發(fā)布時間：2020-06-22 10:37

【摘要】：研究背景:胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,因發(fā)病隱匿且預后較差,具有較高的病死率,而我國更是胃癌大國,每年新發(fā)胃癌病例約占全球的40%。隨著對胃癌發(fā)病的分子信號通路的深入研究,尋找胃癌新的分子靶點受到了廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)化生長因子βII型受體(transforming growth factor beta type II receptor,TGFβR2)通過將細胞外信號轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)傳至細胞內(nèi)而引起多種生物反應(yīng),包括細胞增殖、分化、運動、凋亡及免疫反應(yīng),TGFβR2的失活可引起TGF-β信號通路傳導障礙,導致腫瘤細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是一類高度保守、非編碼的單鏈小分子RNA,通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’untanslated region,3’UTR)結(jié)合,阻遏信使RNA(messenger RNA,mRNA)的翻譯,通常在轉(zhuǎn)錄后水平高效調(diào)控基因表達,密切參與了腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等病理過程。本課題在前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-155在胃癌患者血清中拷貝數(shù)明顯高于正常健康人群;且在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)TGFβR2蛋白水平降低,而TGFβR2 mRNA水平在胃癌組織和癌旁正常胃組織中水平無顯著差異,推測TGFβR2在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生調(diào)控;進一步檢測miR-155水平發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中顯著增高。研究目的:本研究旨在探索在胃癌發(fā)病過程中TGFβR2表達異常的潛在調(diào)控機制,篩選出影響TGFβR2表達的上游miRNA,并探索miRNA-TGFβR2信號通路對胃癌增殖、侵襲、凋亡等生物學行為的影響,進而通過該傳導通路明確新的分子靶點,為胃癌的靶向治療提供新的依據(jù)和思路。研究方法:組織實驗:胃癌組織及癌旁正常組織中TGFβR2的表達情況、TGFβR2mRNA水平及miR-155水平分析。收集來自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除患者的胃腺癌組織及其配對的癌旁正常胃組織,分別應(yīng)用Western blot、qRT-PCR方法檢測TGFβR2蛋白及其mRNA表達水平;采用qRT-PCR中的Taqman探針法檢測組織中miR-155的表達水平。靶點預測:分別使用生物信息學軟件miRanda、TargetScan、PicTar,尋找潛在作用于TGFβR2 mRNA的上游miRNA。體外實驗:明確miR-155-TGFβR2信號通路對胃癌細胞系SGC7901生物學行為的影響。應(yīng)用熒光素酶報告(Luciferase)實驗驗證miR-155能否能直接調(diào)控TGFβR2的表達。分別向SGC7901和MGC803細胞中轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和miR-155inhibitor,并于48小時后提取蛋白、RNA,檢測miR-155表達水平、TGFβR2蛋白表達和TGFβR2 mRNA水平,驗證miR-155對TGFβR2的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor上調(diào)和下調(diào)胃癌細胞系miR-155水平后,通過細胞功能實驗(細胞劃痕實驗、Transwell、細胞增殖實驗)驗證miR-155對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為的影響。轉(zhuǎn)染TGFβR2 siRNA和TGFβR2過表達質(zhì)粒下調(diào)或上調(diào)胃癌細胞系中TGFβR2的表達水平,通過細胞功能實驗(細胞劃痕實驗、Transwell、細胞增殖實驗)驗證TGFβR2對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為的影響。體內(nèi)實驗:驗證miR-155-TGFβR2信號通路在體內(nèi)對腫瘤生長的影響。將未經(jīng)干預的對照組SGC7901、過表達miR-155的SGC7901和轉(zhuǎn)染TGFβR2過表達質(zhì)粒的SGC7901植入裸鼠皮下,4周后處死,剝離腫瘤。拍照腫瘤并測量大小、重量,通過Western blot、qRT-PCR方法檢測檢測瘤組織中TGFβR2的表達情況、TGFβR2 mRNA水平及miR-155水平。同時瘤組織進行HE染色和免疫組化實驗進行分析。研究結(jié)果:組織實驗:TGFβR2在胃腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁正常胃組織,而TGFβR2 mRNA水平在兩種組織中無顯著差異;胃癌組織中miR-155的表達水平較癌旁組織顯著增高。靶點預測:生物信息學軟件預測TGFβR2可能為miR-155的潛在靶點,miR-155與TGFβR2的3’-UTR區(qū)反向互補特異性結(jié)合,并在多物種間高度保守。體外實驗:miR-155通過靶向抑制TGFβR2表達促進胃癌細胞增殖、侵襲、遷移。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示:當把野生型的TGFβR2 mRNA的3’UTR區(qū)的報告基因質(zhì)粒與miR-155 mimics共轉(zhuǎn)染到胃癌細胞中,熒光活性下降;當把野生型報告基因質(zhì)粒與miR-155 inhibitor共轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中,熒光活性增強;當把突變型TGFβR2 mRNA的3’UTR區(qū)的報告基因質(zhì)粒分別與miR-155 mimics和miR-155 inhibitor共轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中,熒光素酶活性未受到影響。證實了miR-155通過靶向結(jié)合TGFβR2 mRNA的3’UTR區(qū)對TGFβR2靶向調(diào)控。通過在胃癌細胞中轉(zhuǎn)染miR-155 mimics使miR-155過表達、轉(zhuǎn)染miR-155inhibitors使miR-155表達受抑制。Western Blot結(jié)果示過表達miR-155時,TGFβR2蛋白表達水平降低;抑制miR-155表達時,TGFβR2蛋白表達水平增高。而無論過表達還是抑制miR-155,TGFβR2 mRNA水平均無明顯改變。細胞功能實驗證實分別將miR-155 mimics、miR-155 inhibitors轉(zhuǎn)染至胃癌細胞系SGC7901中后,過表達miR-155促進了胃癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,而抑制miR-155表達后則抑制了胃癌細胞增殖、侵襲、遷移。轉(zhuǎn)染TGFβR2 siRNA促進了胃癌細胞增殖、侵襲和遷移;過表達TGFβR2質(zhì)粒則抑制了胃癌細胞增殖、侵襲、遷移。體內(nèi)實驗:過表達miR-155組的腫瘤體積、質(zhì)量較對照組、TGFβR2過表達組顯著增大,miR-155水平升高,TGFβR2蛋白表達降低,TGFβR2 mRNA水平較對照組無明顯變化;TGFβR2過表達組腫瘤體積、質(zhì)量較對照組、過表達miR-155組顯著減小,miR-155水平受到抑制,TGFβR2蛋白表達增強,TGFβR2mRNA水平增高。研究結(jié)論:miR-155通過靶向抑制TGFβR2的表達促進胃癌的生長、侵襲。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

圖 1.1 胃癌患者及正常人群血清中 miR-155 的表達量（A）；胃癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織中 miR-155 的表達量（B）。（**代表 P＜0.01）1.2.2 體外實驗證實 miR-155 對胃癌生物學行為的影響1.2.2.1 構(gòu)建穩(wěn)定過表達/沉默 miR-155 的 SGC7901 細胞系首先構(gòu)建在 SGC7901 中穩(wěn)定過表達 miR-155 的細胞系及其相對照的慢病毒空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SGC7901 細胞系；構(gòu)建在 SGC7901 中 miR-155 表達沉默的細胞系及其相對照的慢病毒空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SGC7901 細胞系。即分別將 miR-155 mimics（miR-155 類似物）、NC mimics、miR-155 inhibitors（miR-155 抑制物）、NCinhibitors 分別轉(zhuǎn)染至 SGC7901 細胞系中。轉(zhuǎn)染成功后利用 qRT-PCR 技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的SGC7901細胞中的miR-155水平進行定量分析。如圖1.2所示，轉(zhuǎn)染miR-155mimics 組中，胃癌細胞內(nèi) miR-155 水平明顯升高，明顯高于兩個慢病毒空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和 miR-155 inhibitors 組；轉(zhuǎn)染 miR-155 inhibitors 組中，胃癌細胞內(nèi)miR-155 水平在 4 組中最低。因此，分別通過轉(zhuǎn)染 miR-155 mimics 或 inhibitors可上調(diào)或下調(diào)胃癌細胞系中 miR-155 表達水平。

（miR-155 類似物）、NC mimics、miR-155 inhibitors（miR-155 抑制物）、NCinhibitors 分別轉(zhuǎn)染至 SGC7901 細胞系中。轉(zhuǎn)染成功后利用 qRT-PCR 技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的SGC7901細胞中的miR-155水平進行定量分析。如圖1.2所示，轉(zhuǎn)染miR-155mimics 組中，胃癌細胞內(nèi) miR-155 水平明顯升高，明顯高于兩個慢病毒空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和 miR-155 inhibitors 組；轉(zhuǎn)染 miR-155 inhibitors 組中，胃癌細胞內(nèi)miR-155 水平在 4 組中最低。因此，分別通過轉(zhuǎn)染 miR-155 mimics 或 inhibitors可上調(diào)或下調(diào)胃癌細胞系中 miR-155 表達水平。圖 1.2 轉(zhuǎn)染 miR-155 mimics 和 miR-155 inhibitors 后胃癌細胞中 miR-155 的表達水平。（***代表 P＜0.001）A B

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2725568