【摘要】：背景:涎腺腺樣囊性癌是發(fā)生于腮腺,頜下腺,舌下腺以及小唾液腺的腫瘤,惡性程度高,是唾液腺最常見的惡性腫瘤之一。涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生常會影響唾液腺的分泌,致使口腔干燥,進食困難,疼痛明顯,又因好發(fā)于頜面部,常會影響患者的美觀,極大的降低了患者的生活質(zhì)量。目前涎腺腺樣囊性癌的治療以手術(shù)切除為主,輔以術(shù)后放療和化療,但是,其復(fù)發(fā)率較高。為了降低涎腺腺樣囊性癌的復(fù)發(fā)率,我們需要尋找新的富有療效的化療藥。表柔比星是一種化療藥,已經(jīng)被廣泛用于膀胱癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤的治療,療效顯著,但是其對涎腺腺樣囊性癌的作用尚不清楚。小檗堿是一種在我國應(yīng)用很久的中藥,起初被用于解熱鎮(zhèn)痛,抗菌及胃腸道疾病的治療,近年來,科研工作者們發(fā)現(xiàn)其還具有抗腫瘤的作用,但目前尚無小檗堿對涎腺腺樣囊性癌作用的研究。因此,我們的實驗評估了表柔比星和小檗堿對涎腺腺樣囊性癌ACC2細胞系增殖,凋亡和自噬的影響。目的:1.評估表柔比星和小檗堿對腺樣囊性癌ACC2細胞系增殖、凋亡和自噬的影響。2.研究表柔比星誘導(dǎo)ACC2細胞凋亡的機制。3.評估自噬與細胞耐藥性的關(guān)系。方法:1.首先,利用CCK8試劑盒檢測小檗堿(0μg/ml,3.5μg/ml,7.0μg/ml,14μg/ml)和表柔比星(0μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml,2.0μg/ml)在不同濃度下對涎腺腺樣囊性癌ACC2細胞系增殖活性的影響。其次,檢測小檗堿(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)在不同作用時間下(24 h,48 h,and 72 h)對ACC2細胞增殖活性的影響。2.分別用小檗堿(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)處理ACC2細胞后,用Annexin V-FITC/PI對細胞進行染色,后進行流式分析,評估細胞凋亡的情況。3.應(yīng)用western blot實驗檢測小檗堿(7.0μg/ml)和表柔比星(1.0μg/ml)處理后ACC2細胞中LC3和P62的蛋白表達量,同時應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測自噬小點的數(shù)量,研究表柔比星和小檗堿對ACC2細胞自噬的影響。4.應(yīng)用western blot實驗和免疫熒光技術(shù)檢測表柔比星(1.0μg/ml)處理后細胞Bax、Bcl-2、細胞色素C蛋白表達量,研究表柔比星誘導(dǎo)細胞凋亡的機制。應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù),檢測表柔比星(1.0μg/ml)處理后Bax和Bcl-2信使RNA的表達量,進一步研究藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的機制。5.在表柔比星處理的細胞中加入自噬抑制劑氯喹,抑制自噬。再運用CCK8實驗和Annexin V/PI染色法評估自噬對藥物誘導(dǎo)凋亡的影響。結(jié)果:1.相同作用時間下,隨著表柔比星和小檗堿濃度的升高,細胞活性逐漸降低。相同濃度下,表柔比星和小檗堿作用時間越長,細胞活性越低。2.小檗堿濃度在7.0μg/ml,作用24h時,約14.2%的細胞出現(xiàn)凋亡,表柔比星濃度在1.0μg/ml,作用24h時,約10.4%的細胞出現(xiàn)凋亡。3.western blot實驗中,表柔比星處理的細胞中LC3II蛋白表達量增加,LC3I表達量變化不明顯,P62蛋白表達量減少。而小檗堿處理的細胞中LC3I、LC3II和P62的蛋白表達量均無明顯變化。免疫熒光實驗中,表柔比星處理的細胞中自噬小點明顯增加。4.western blot實驗和免疫熒光技術(shù)均顯示細胞Bax和細胞色素C的蛋白表達量明顯增高,而Bcl-2蛋白表達量變化不顯著。實時熒光定量PCR顯示Bax的mRNA相對表達量明顯增高,而Bcl-2的表達量變化無統(tǒng)計學意義。5.CCK8實驗顯示:表柔比星和氯喹聯(lián)合用藥組細胞活性明顯低于表柔比星單獨用藥組。Annexin V/PI染色法顯示:表柔比星和氯喹聯(lián)合用藥組細胞凋亡比例顯著高于表柔比星單獨用藥組。結(jié)論:1.表柔比星和小檗堿可以降低ACC2細胞增殖活性,呈劑量和時間依賴性。表柔比星對細胞的作用強于小檗堿。2.表柔比星和小檗堿均可以誘導(dǎo)ACC2細胞凋亡。3.表柔比星可以誘導(dǎo)ACC2細胞發(fā)生自噬。小檗堿對自噬無明顯影響。4.表柔比星通過提高Bax的表達,促進細胞色素C的釋放,最終誘導(dǎo)ACC2細胞凋亡。5.自噬增加了ACC2細胞對表柔比星的耐藥性。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.8
【圖文】：

圖 3.1 表柔比星（EPI）和小檗堿（BER）對 ACC2 細胞的作用呈劑量和時間依賴性A：表柔比星處理 ACC2 細胞 24h 后，用 CCK8 試驗檢測細胞活性，表柔比星濃度分別為：0 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1.0 μg/ml, 2.0 μg/ml B：小檗堿處理處理 ACC2細胞 24h后，用 CCK8 試驗檢測細胞活性，小檗堿濃度分別為：0 μg/ml, 3.5 μg/ml,7.0μg/ml, 14 μg/ml C：分別用固定濃度的表柔比星（1.0 μg/ml）和小檗堿（7.0μg/ml）處理 ACC2 細胞 24h，48h，72h后，CCK8 試驗檢測其活性3.3 表柔比星能誘導(dǎo)細胞自噬LC3 蛋白和 P62 蛋白與細胞自噬密切相關(guān)，它們的表達量能夠反映細胞自噬的強弱。LC3 合成后，最初是以 LC3 前體的形式存在[3]，

12 3.2 表柔比星（EPI）和小檗堿（BER）對 ACC2 細胞凋亡及自噬的作用表柔比星（1.0 μg/ml）、小檗堿（7.0μg/ml）或 DMSO（對照）處理 ACC2 細24h 后，收集細胞，Annexin V-FITC/PI 染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況表柔比星（1.0 μg/ml）或 DMSO 處理 ACC2 細胞 24h 后行 western blot 試驗蛋白表達 C：表柔比星（1.0 μg/ml）或 DMSO 處理 ACC2 細胞 24h后，熒光試驗檢測自噬小點數(shù)量，照片由高內(nèi)涵成像系統(tǒng)拍攝并進行數(shù)據(jù)處理。比星處理組中可見大量自噬小點。D：表柔比星處理組自噬陽性細胞比例顯于對照組。(*P＜0.05)

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 柯學平;姚瑤;顏廷元;張瑞;袁春平;楊建榮;;p27及皮層肌動蛋白的表達與涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲的相關(guān)性[J];江蘇醫(yī)藥;2013年03期

2 陳偉;董震;蘇寒;曹罡;孟昭業(yè);張森林;;涎腺腺樣囊性癌組織中神經(jīng)生長因子表達及其臨床病理特征的Meta分析[J];醫(yī)學研究生學報;2012年02期

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本文編號：2724449