發(fā)布時(shí)間：2020-06-21 08:11

【摘要】：目的:三陰乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性乳腺腫瘤,由于缺乏雌激素受體的表達(dá)和HER2/NEU基因的擴(kuò)增而沒有適合的作用靶點(diǎn),因而化療是最好的選擇。但是由于TNBC病人對化療藥物的抗性,使得預(yù)后較差,并且伴有較高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移能力。最近研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用,然而circRNAs在TNBC中的作用還不是很清楚。方法:微陣列芯片分析篩選三陰乳腺癌病人組織和非癌組織、細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549以及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA;設(shè)計(jì)circRAD18特異的反向剪接引物,Sanger測序驗(yàn)證其序列;生物信息學(xué)預(yù)測circRAD18靶向結(jié)合的miRNA,Targetscan、miRBase預(yù)測miR-1299、miR-498的共同靶基因;雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證mi R-1299、miR-498與CDK6的靶向關(guān)系;qRT-PCR檢測circRAD18、CDK6、mi R-1299、miR-498的RNA表達(dá)水平;EdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力;細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的凋亡情況;平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測克隆形成能力;Transwell檢測TNBC細(xì)胞的侵襲能力;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的周期變化情況;Western blot檢測CDK6、pRb、cyclinD1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:微陣列分析篩選三陰乳腺癌組織和細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNAs,其中circRAD18在TNBC組織和細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)(差異倍數(shù)2),并將其命名為circRAD18。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,相比正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A以及非三陰乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、BT474、Skbr3),circRAD18在TNBC細(xì)胞系(HCC38、MDA-MB-468、BT549、MDA-MB-231)中表達(dá)上調(diào),表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05,n=3)。circRAD18的三個干擾序列經(jīng)檢測si-circRAD-S1干擾效率最高。在TNBC細(xì)胞中,下調(diào)circRAD18的表達(dá)后,TNBC細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力以及侵襲能力顯著降低,并能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circRAD18與miR-1299、miR-498有較高的結(jié)合率。qRT-PCR發(fā)現(xiàn)circRAD18敲低,miR-1299、miR-498表達(dá)降低,而mi R-1299、mi R-498表達(dá)抑制后并不影響circRAD18的表達(dá)。Targetscan、miRbase預(yù)測miR-1299、miR-498的靶基因,發(fā)現(xiàn)它們能夠共同靶向CDK6。雙熒光素酶報(bào)告基因顯示mi R-1299、miR-498能夠靶向CDK6,共轉(zhuǎn)染miR-1299、mi R-498的mimics后效果更好。qRT-PCT顯示轉(zhuǎn)染mi R-1299、miR-498的inhibitor后CDK6表達(dá)升高,轉(zhuǎn)染mimics后CDK6表達(dá)降低,其中共轉(zhuǎn)染miR-1299、miR-498組效果更為顯著。接著,共轉(zhuǎn)染miR-1299、mi R-498的inhibitor或者mimics后,EdU增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mi R-1299、miR-498表達(dá)抑制促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖,過表達(dá)則抑制TNBC細(xì)胞的增殖;細(xì)胞周期顯示mi R-1299、mi R-498表達(dá)抑制能夠推進(jìn)細(xì)胞周期向G2/S期轉(zhuǎn)化,過表達(dá)則將細(xì)胞周期阻滯在G1期;Western blot發(fā)現(xiàn)mi R-1299、miR-498表達(dá)抑制后CDK6、pRb、cyclinD1蛋白表達(dá)升高,過表達(dá)則抑制CDK6、pRb、cyclinD1蛋白的表達(dá)。接著共轉(zhuǎn)染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染si-circRAD18和mi R-1299、miR-498的inhibitor能夠恢復(fù)si-circ RAD18引起的CDK6 mRNA水平表達(dá)下調(diào);EdU增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染si-circRAD18和mi R-1299、miR-498的inhibitor能夠在一定程度上恢復(fù)si-circ RAD引起的TNBC細(xì)胞增殖的抑制;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor能夠恢復(fù)si-crc RAD18引起的細(xì)胞周期在G1期的阻滯;Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor能夠恢復(fù)si-circRAD18引起的CDK6、cyclin D1、pRb表達(dá)降低。結(jié)論:1、circRAD18在三陰乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào);2、circRAD18在三陰乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá),而在正常乳腺細(xì)胞、非三陰乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)沒有差異;3、沉默circRAD18的表達(dá),能夠抑制TNBC的增殖能力、克隆形成能力和侵襲能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡;4、circRAD18能夠下調(diào)miR-1299、mi R-498的表達(dá);5、mi R-1299、mi R-498能夠共同靶向CDK6抑制細(xì)胞周期進(jìn)程;6、circRAD18是通過下調(diào)miR-1299、miR-498的表達(dá)來調(diào)節(jié)CDK6,從而促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖能力。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

As 在三陰乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜先利用 circRNA 基因芯片篩選 TNBC 組織和非癌組織、細(xì)胞系對TNBC癌組織和非癌組織以及MDA-MB-231、MDA-MB-468的中差異表達(dá)的 circRNAs，發(fā)現(xiàn)多種 circRNA 在 TNBC 組織和所有的表達(dá)的 circRNAs 的分層聚類表明 circRNAs 在 TNBC 組（圖 1A）。散點(diǎn)圖和火山圖（圖 1B、C、）顯示 TNBC 和 NTN 細(xì)胞系和正常乳腺上皮細(xì)胞之間 circRNA 表達(dá)的變化。我們總變倍數(shù)大于兩倍的差異表達(dá)的 circRNA，其中三對病人組織中A 有 173 個，表達(dá)下調(diào)的有 77 個 ，在三株 TNBC 細(xì)胞系中都A 有 433 個，下調(diào)的有 657 個，綜合病人組織和三株 TNBC 細(xì)組織和三株細(xì)胞系中均上調(diào)的 circRNA 有 11 個，下調(diào)的有 3 個達(dá)超過 2 倍的變化的 circRNA。

27圖 2 circRAD18 在 TNBC 中的表達(dá)A：circRAD18 的基因組位點(diǎn),并利用 Sanger 測序進(jìn)行驗(yàn)證，箭頭表示與 circRAD18 的基組區(qū)域結(jié)合的不同引物。B：qRT-PCR 檢測 circRAD18 在不同乳腺癌細(xì)胞系以及正常乳腺上細(xì)胞（MCF-10A）中的表達(dá)情況，結(jié)果表明 circRAD18 在 TNBC 細(xì)胞系中高表達(dá)。4.3 circRNA-RAD18 參與三陰乳腺癌細(xì)胞的病理進(jìn)程為了評估 circRAD18 在 TNBC 中的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了 circRNA 特異的干擾序列來沉默 TNBC 細(xì)胞 MDA-MB-231、HCC38 中 circRAD18 的表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 薛梅;李旭;陳葳;;人UCA1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的生物信息學(xué)分析與鑒定[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2013年11期

2 謝小娟;李旭;王帆;陳葳;;非編碼RNAUCA1基因的細(xì)胞定位和組織表達(dá)譜分析[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

本文編號：2723790