【摘要】：目的:三陰乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性乳腺腫瘤,由于缺乏雌激素受體的表達和HER2/NEU基因的擴增而沒有適合的作用靶點,因而化療是最好的選擇。但是由于TNBC病人對化療藥物的抗性,使得預后較差,并且伴有較高復發(fā)率和轉移能力。最近研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用,然而circRNAs在TNBC中的作用還不是很清楚。方法:微陣列芯片分析篩選三陰乳腺癌病人組織和非癌組織、細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549以及正常乳腺上皮細胞MCF-10A中差異表達的環(huán)狀RNA;設計circRAD18特異的反向剪接引物,Sanger測序驗證其序列;生物信息學預測circRAD18靶向結合的miRNA,Targetscan、miRBase預測miR-1299、miR-498的共同靶基因;雙熒光素酶報告基因驗證mi R-1299、miR-498與CDK6的靶向關系;qRT-PCR檢測circRAD18、CDK6、mi R-1299、miR-498的RNA表達水平;EdU增殖實驗檢測細胞增殖能力;細胞凋亡實驗檢測細胞的凋亡情況;平板克隆實驗檢測克隆形成能力;Transwell檢測TNBC細胞的侵襲能力;細胞周期實驗檢測細胞的周期變化情況;Western blot檢測CDK6、pRb、cyclinD1蛋白的表達情況。結果:微陣列分析篩選三陰乳腺癌組織和細胞中差異表達的circRNAs,其中circRAD18在TNBC組織和細胞系中均表達上調(差異倍數(shù)2),并將其命名為circRAD18。qRT-PCR檢測結果顯示,相比正常乳腺上皮細胞MCF-10A以及非三陰乳腺癌細胞系(MCF-7、BT474、Skbr3),circRAD18在TNBC細胞系(HCC38、MDA-MB-468、BT549、MDA-MB-231)中表達上調,表達存在統(tǒng)計學差異(p0.05,n=3)。circRAD18的三個干擾序列經(jīng)檢測si-circRAD-S1干擾效率最高。在TNBC細胞中,下調circRAD18的表達后,TNBC細胞的增殖能力、克隆形成能力以及侵襲能力顯著降低,并能誘導細胞的凋亡。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)circRAD18與miR-1299、miR-498有較高的結合率。qRT-PCR發(fā)現(xiàn)circRAD18敲低,miR-1299、miR-498表達降低,而mi R-1299、mi R-498表達抑制后并不影響circRAD18的表達。Targetscan、miRbase預測miR-1299、miR-498的靶基因,發(fā)現(xiàn)它們能夠共同靶向CDK6。雙熒光素酶報告基因顯示mi R-1299、miR-498能夠靶向CDK6,共轉染miR-1299、mi R-498的mimics后效果更好。qRT-PCT顯示轉染mi R-1299、miR-498的inhibitor后CDK6表達升高,轉染mimics后CDK6表達降低,其中共轉染miR-1299、miR-498組效果更為顯著。接著,共轉染miR-1299、mi R-498的inhibitor或者mimics后,EdU增殖實驗發(fā)現(xiàn)mi R-1299、miR-498表達抑制促進TNBC細胞增殖,過表達則抑制TNBC細胞的增殖;細胞周期顯示mi R-1299、mi R-498表達抑制能夠推進細胞周期向G2/S期轉化,過表達則將細胞周期阻滯在G1期;Western blot發(fā)現(xiàn)mi R-1299、miR-498表達抑制后CDK6、pRb、cyclinD1蛋白表達升高,過表達則抑制CDK6、pRb、cyclinD1蛋白的表達。接著共轉染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)共轉染si-circRAD18和mi R-1299、miR-498的inhibitor能夠恢復si-circ RAD18引起的CDK6 mRNA水平表達下調;EdU增殖實驗發(fā)現(xiàn)共轉染si-circRAD18和mi R-1299、miR-498的inhibitor能夠在一定程度上恢復si-circ RAD引起的TNBC細胞增殖的抑制;細胞周期實驗發(fā)現(xiàn)共轉染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor能夠恢復si-crc RAD18引起的細胞周期在G1期的阻滯;Western blot實驗發(fā)現(xiàn)共轉染si-circRAD18和mi R-1299、mi R-498的inhibitor能夠恢復si-circRAD18引起的CDK6、cyclin D1、pRb表達降低。結論:1、circRAD18在三陰乳腺癌組織和細胞中表達上調;2、circRAD18在三陰乳腺癌細胞系中高表達,而在正常乳腺細胞、非三陰乳腺癌細胞系中表達沒有差異;3、沉默circRAD18的表達,能夠抑制TNBC的增殖能力、克隆形成能力和侵襲能力,并誘導細胞的凋亡;4、circRAD18能夠下調miR-1299、mi R-498的表達;5、mi R-1299、mi R-498能夠共同靶向CDK6抑制細胞周期進程;6、circRAD18是通過下調miR-1299、miR-498的表達來調節(jié)CDK6,從而促進TNBC細胞的增殖能力。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

As 在三陰乳腺癌組織和細胞中的表達譜先利用 circRNA 基因芯片篩選 TNBC 組織和非癌組織、細胞系對TNBC癌組織和非癌組織以及MDA-MB-231、MDA-MB-468的中差異表達的 circRNAs，發(fā)現(xiàn)多種 circRNA 在 TNBC 組織和所有的表達的 circRNAs 的分層聚類表明 circRNAs 在 TNBC 組（圖 1A）。散點圖和火山圖（圖 1B、C、）顯示 TNBC 和 NTN 細胞系和正常乳腺上皮細胞之間 circRNA 表達的變化。我們總變倍數(shù)大于兩倍的差異表達的 circRNA，其中三對病人組織中A 有 173 個，表達下調的有 77 個 ，在三株 TNBC 細胞系中都A 有 433 個，下調的有 657 個，綜合病人組織和三株 TNBC 細組織和三株細胞系中均上調的 circRNA 有 11 個，下調的有 3 個達超過 2 倍的變化的 circRNA。

27圖 2 circRAD18 在 TNBC 中的表達A：circRAD18 的基因組位點,并利用 Sanger 測序進行驗證，箭頭表示與 circRAD18 的基組區(qū)域結合的不同引物。B：qRT-PCR 檢測 circRAD18 在不同乳腺癌細胞系以及正常乳腺上細胞（MCF-10A）中的表達情況，結果表明 circRAD18 在 TNBC 細胞系中高表達。4.3 circRNA-RAD18 參與三陰乳腺癌細胞的病理進程為了評估 circRAD18 在 TNBC 中的生物學功能，我們構建了 circRNA 特異的干擾序列來沉默 TNBC 細胞 MDA-MB-231、HCC38 中 circRAD18 的表達。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 薛梅;李旭;陳葳;;人UCA1基因轉錄調控的生物信息學分析與鑒定[J];南方醫(yī)科大學學報;2013年11期

2 謝小娟;李旭;王帆;陳葳;;非編碼RNAUCA1基因的細胞定位和組織表達譜分析[J];南方醫(yī)科大學學報;2010年01期

本文編號：2723790