【摘要】：一、研究背景:前列腺癌(prostate cancer,PCa)是中老年男性常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,目前在全球范圍內(nèi)PCa的發(fā)病率和病死率在所有男性腫瘤中分別居于第2位和第6位。特別在發(fā)達(dá)國(guó)家的男性中,PCa已成為發(fā)病率最高的腫瘤,根據(jù)2018年最新的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),美國(guó)每年估計(jì)有164,690例的PCa新發(fā)病例,并導(dǎo)致每年約29,430人死亡。相對(duì)西方國(guó)家,亞洲區(qū)域PCa發(fā)病率和病死率較低。中國(guó)PCa發(fā)病率及病死率雖低于世界平均水平,但隨著近年以前列腺特異性抗原(PSA)篩查為代表的前列腺癌早期篩查技術(shù)普及,中國(guó)PCa的發(fā)病率正快速升高。據(jù)2015年最新公布的數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)PCa發(fā)病率達(dá)60.3/10萬(wàn)人,位于男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位,且有逐年增高的趨勢(shì),PCa死亡率高達(dá)26.6/10萬(wàn)人。早期篩查使得在大多數(shù)患者在前列腺癌早期被發(fā)現(xiàn),通過(guò)根治性治療提供相對(duì)有利的預(yù)后并獲得長(zhǎng)期存活。然而,許多患者首診即為中晚期前列腺癌或因腫瘤復(fù)發(fā)并最終進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC),盡管標(biāo)準(zhǔn)化使用雄激素剝奪療法(ADT)可以延緩局部晚期或轉(zhuǎn)移性PCa患者的疾病進(jìn)展。但這些患者的治療方法有限,預(yù)后通常較差。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致90%癌癥相關(guān)死亡的原因,PCa是最容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的人類(lèi)癌癥之一,CRPC患者,特別是轉(zhuǎn)移性CRPC(mCRPC)患者能夠從ADT療中獲益有限。因此,探索PCa發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在途徑并尋找針對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移的新的有效的生物分子靶點(diǎn),以便制定更好的CRPC治療方法及腫瘤骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防策略為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。PDLIM5(PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域蛋白5,PDZ and LIM domain protein5,PDLIM5)是由N-末端的PDZ結(jié)構(gòu)域和C-末端的三個(gè)連續(xù)的LIM結(jié)構(gòu)域組成的63kDa的細(xì)胞質(zhì)蛋白,由Kuroda等人于1996年通過(guò)以蛋白激酶C(PKC)為誘餌蛋白的酵母雙雜交技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)。PDLIM5可通過(guò)其PDZ結(jié)構(gòu)域錨定于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架并招募肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白。因此PDLIM5被認(rèn)為參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)組成,細(xì)胞系分化,器官發(fā)育和腫瘤形成。由于已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)PDLIM5的功能主要與調(diào)節(jié)突觸強(qiáng)度的功能有關(guān),故大量的研究集中在PDLIM5與精神疾病如精神分裂癥和抑郁癥之間的關(guān)聯(lián)上。此外,PDLIM5被認(rèn)為是細(xì)胞遷移形成板狀偽足所必需的:PDLIM5通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)失活后,可過(guò)滅活Rac1(Rho家族蛋白)來(lái)削弱細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。在腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移方面,根據(jù)最近的研究,PDLIM5可能參與多種癌癥的發(fā)展,包括甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌及胃癌。Koutros等報(bào)道,通過(guò)使用基因芯片檢測(cè),PDLIM5 mRNA在PCa組織中過(guò)度表達(dá)。Ma W等報(bào)道,PDLIM5可能被證明是血清和尿液分析輔助診斷的分子靶點(diǎn),并且在預(yù)測(cè)晚期前列腺癌進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)方面具有潛在價(jià)值。目前已知細(xì)胞遷移侵襲與細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化緊密相關(guān):細(xì)胞骨架的排列,特別是含有肌動(dòng)蛋白的微絲骨架重塑是決定細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)性的關(guān)鍵因素。PDLIM5是明確的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,可能在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用,因此了解PDLIM5在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制將有助于改善PCa,特別是處于CRPC階段前列腺癌患者的治療方法及預(yù)后。AMP依賴(lài)的蛋白激酶(AMPK)為常見(jiàn)的能量受體復(fù)合體,其可在缺氧,缺血再灌注,葡萄糖供給不足等應(yīng)激條件過(guò)程中被激活。研究表明AMPK的激活與腫瘤生長(zhǎng)和增殖,細(xì)胞周期,凋亡,血管形成和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。在這項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘和實(shí)驗(yàn)研究,PDLIM5在PCa組織中較正常前列腺組織高表達(dá)。另外,PDLIM5可以通過(guò)與AMPK結(jié)合并發(fā)揮生理功能。因此,我們利用表達(dá)短發(fā)夾RNA的慢病毒,在PC-3和DU145細(xì)胞中沉默了PDLIM5基因,觀察了癌細(xì)胞的功能表型變化,揭示了PDLIM5的PCa腫瘤發(fā)生的潛在調(diào)控機(jī)制。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)研究PDLIM5在前列腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平,驗(yàn)證PDLIM5在前列腺癌中的異常高表達(dá)。篩選高表達(dá)PDLIM5細(xì)胞株進(jìn)一步進(jìn)行生物功能學(xué)實(shí)驗(yàn),以探索PDLIM5介導(dǎo)腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制。三、實(shí)驗(yàn)方法(一)PDLIM5在前列腺癌相關(guān)芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá)分析及組織標(biāo)本驗(yàn)證收集Oncomine、PROGGENE數(shù)據(jù)庫(kù)中的前列腺癌樣本中PDLIM5表達(dá)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)信息,驗(yàn)證PDLIM5在癌和正常腺體中的表達(dá)差異,明確高表達(dá)PDLIM5與PCa轉(zhuǎn)移預(yù)后的相關(guān)性。進(jìn)一步收集長(zhǎng)征醫(yī)院泌尿外科前列腺癌根治術(shù)后臨床組織樣本44例,運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)癌和癌旁組織標(biāo)本明確PDLIM5組織表達(dá)水平。(二)前列腺癌PDLIM5敲減細(xì)胞株篩選及構(gòu)建與沉默效率驗(yàn)證在PCa常見(jiàn)細(xì)胞系中通過(guò)Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表達(dá)情況,選取高表達(dá)PDLIM5的轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞株DU145和PC-3作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象,構(gòu)建包含靶向干擾PDLIM5的質(zhì)粒的慢病毒進(jìn)行細(xì)胞感染。觀察質(zhì)粒上的報(bào)告基因熒光強(qiáng)度,并分別在mRNA及蛋白水平驗(yàn)證PDLIM5的敲減效率,確認(rèn)沉默PDLIM5的細(xì)胞株構(gòu)建成功。(三)檢測(cè)PDLIM5沉默后前列腺癌細(xì)胞株增殖、細(xì)胞周期凋亡水平變化及對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移能力影響在穩(wěn)定沉默PDLIM5的DU145和PC-3細(xì)胞中,通過(guò)MTT比色法、克隆形成試驗(yàn)來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖能力的變化;通過(guò)細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡水平變化以明確PDLIM5敲減后對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期阻滯及誘導(dǎo)凋亡作用;通過(guò)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及TRANSWELL實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)PDLIM5對(duì)腫瘤遷移侵襲的影響。(四)PDLIM5對(duì)前列腺癌增殖轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制的初步探究根據(jù)細(xì)胞表型相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)庫(kù)信息分析,PDLIM5對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力具有顯著影響。我們首先在PDLIM5沉默狀態(tài)下通過(guò)Western Blot和qPCR對(duì)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子進(jìn)行了檢測(cè),隨后通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,在同種細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)PDLIM5,檢測(cè)EMT相關(guān)分子表達(dá)回復(fù)情況,并分別在PDLIM5敲減及過(guò)表達(dá)兩種情況下對(duì)前列腺骨轉(zhuǎn)移相關(guān)分析因子進(jìn)行檢測(cè)。最后通過(guò)免疫共沉淀,確定PDLIM5與AMPK的相互作用并對(duì)敲減PDLIM5后AMPK磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè),探索PDLIM5-AMPK-EMT的調(diào)控機(jī)制。(五)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究PDLIM5在體內(nèi)功能作用使用沉默PDLIM5的DU145細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),觀察體內(nèi)環(huán)境下PDLIM5敲減后對(duì)細(xì)胞成瘤及增殖能力的影響。隨后將取瘤體組織進(jìn)行裂解,通過(guò)Western Blot對(duì)PDLIM5蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),明確PDLIM5的沉默效率并檢測(cè)AMPK、EMT相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)變化,明確在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中PDLIM5對(duì)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.發(fā)現(xiàn)PDLIM5在PCa組織中異常高表達(dá),并且與PCa生化復(fù)發(fā)與生存期相關(guān)。通過(guò)免疫組化及生物信息學(xué)分析方法,確認(rèn)PDLIM5在PCa中較正常前列腺組織表達(dá)水平升高,且深入分析數(shù)據(jù)庫(kù)芯片資料發(fā)現(xiàn)異常高表達(dá)的PDLIM5與預(yù)后不良因素如:轉(zhuǎn)移、高Gleason評(píng)分及TMN分期相關(guān)。同時(shí),通過(guò)多因素分析及生存分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PDLIM5是PCa生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素并導(dǎo)致患者總生存率下降。2.成功建立穩(wěn)定沉默PDLIM5的DU145及PC-3細(xì)胞株,通過(guò)相關(guān)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默PDLIM5可導(dǎo)致前列癌細(xì)胞惡性增殖、克隆形成、侵襲轉(zhuǎn)移能力受抑制,并可誘導(dǎo)G2/M阻滯和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。3.檢測(cè)PDLIM5敲減后上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子表達(dá)水平,通過(guò)WesternBlot及qPCR發(fā)現(xiàn)人緊密連接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出現(xiàn)不同程度下調(diào),而EMT關(guān)鍵分子E-cadherin表達(dá)量上升,證實(shí)EMT過(guò)程受到抑制。4.在DU145及PC-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PDLIM5可以在一定程度上通過(guò)上調(diào)SNAIL的表達(dá),從而使及關(guān)鍵分子E-cadherin表達(dá)量下降,證實(shí)PDLIM5對(duì)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響與EMT密切相關(guān)。同時(shí)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)已知促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子,如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF),甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)。qPCR結(jié)果顯示,沉默PDLIM5后,PC-3細(xì)胞中這些促腫瘤轉(zhuǎn)移因子的表達(dá)顯著下調(diào)。當(dāng)PDLIM5過(guò)表達(dá)時(shí),這些分子的表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào),且在DU145細(xì)胞中也觀察到類(lèi)似的結(jié)果,進(jìn)一步證實(shí)PDLIM5在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中起作用5.免疫共沉淀確定PDLIM5可與AMPK相結(jié)合,敲減PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。隨后通過(guò)放線菌素阻斷上游蛋白質(zhì)合成,在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)AMPK蛋白水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDLIM5沉默組AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通過(guò)維持AMPK的穩(wěn)定性,使AMPK通路持續(xù)性激活,從而促進(jìn)前列腺癌的惡性增殖及轉(zhuǎn)移。6.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明在體內(nèi)條件下,沉默PDLIM5可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)組織蛋白水平檢測(cè),在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中PDLIM5同樣可通過(guò)AMPK-EMT相關(guān)通路對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)控。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究證實(shí)了PDLIM5表達(dá)水平在PCa組織中發(fā)生上調(diào),表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析探索PDLIM5與PCa復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系,表明高表達(dá)PDLIM5是前列腺癌預(yù)后不良的相關(guān)因素。此外,細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都表明,PDLIM5通過(guò)激活A(yù)MPK通路可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)EMT介導(dǎo)的侵襲和轉(zhuǎn)移。探索PDLIM5相關(guān)相關(guān)通路及作用靶點(diǎn)可能有助于豐富PCa的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制,并為mCRPC患者帶來(lái)新的治療策略。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【圖文】：

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)限定條件進(jìn)行搜索，剃除DNA表達(dá)數(shù)據(jù)芯片，共有12組芯片數(shù)據(jù)中PDLIM5在前列腺癌中較正常前列腺腺體高表達(dá)，將這12例數(shù)據(jù)芯片結(jié)果進(jìn)行匯總，結(jié)果如圖1所示，其中紅色代表PDLIM5在癌組織中高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)，且顏色越深代表差異性更顯著。圖1．PDLIM5 mRNA表達(dá)水平在PCa組織中顯著升高。對(duì)ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)12個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)芯片進(jìn)行匯總發(fā)現(xiàn)無(wú)論單個(gè)芯片數(shù)據(jù)還是整合的薈萃分析中，PDLIM5均在前列腺癌組織中異常高表達(dá)。選取數(shù)據(jù)芯片來(lái)源如圖所示，薈萃分析統(tǒng)計(jì)量P<0.001，MedianRank：44.5。我們選取Lapointe Prostate、Luo Prostate、Welsh Prostate、Arredouani Prostate 4個(gè)芯片對(duì)PDLIM5單個(gè)表達(dá)水平進(jìn)行摘錄，重新進(jìn)行繪圖并統(tǒng)計(jì)分析，同樣證實(shí)PDLIM5在這個(gè)4個(gè)數(shù)據(jù)芯片中的癌組織表達(dá)水平升高，如圖2.

圖2. Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中4個(gè)代表性基因芯片中的PDLIM5在PCa與正常腺體中的平比較情況。（二） 免疫組化方法在組織標(biāo)本中驗(yàn)證 PDLIM5 在前列腺癌腺體組織中差異表達(dá)在數(shù)據(jù)庫(kù)中，我們初步證實(shí)了PDLIM5在PCa中表達(dá)水平升高，為進(jìn)一步在組織行PDLIM5的驗(yàn)證，為下一步細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)，我們利用免疫組化方法在患者組織中對(duì)PDLIM5表達(dá)水平再次驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)染色拍照評(píng)分，PDLIM5在癌及織中差異性表達(dá)結(jié)果如表一所示。

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本文編號(hào)：2722371