【摘要】：一、研究背景:前列腺癌(prostate cancer,PCa)是中老年男性常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,目前在全球范圍內PCa的發(fā)病率和病死率在所有男性腫瘤中分別居于第2位和第6位。特別在發(fā)達國家的男性中,PCa已成為發(fā)病率最高的腫瘤,根據(jù)2018年最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù),美國每年估計有164,690例的PCa新發(fā)病例,并導致每年約29,430人死亡。相對西方國家,亞洲區(qū)域PCa發(fā)病率和病死率較低。中國PCa發(fā)病率及病死率雖低于世界平均水平,但隨著近年以前列腺特異性抗原(PSA)篩查為代表的前列腺癌早期篩查技術普及,中國PCa的發(fā)病率正快速升高。據(jù)2015年最新公布的數(shù)據(jù)顯示,我國PCa發(fā)病率達60.3/10萬人,位于男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位,且有逐年增高的趨勢,PCa死亡率高達26.6/10萬人。早期篩查使得在大多數(shù)患者在前列腺癌早期被發(fā)現(xiàn),通過根治性治療提供相對有利的預后并獲得長期存活。然而,許多患者首診即為中晚期前列腺癌或因腫瘤復發(fā)并最終進展為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC),盡管標準化使用雄激素剝奪療法(ADT)可以延緩局部晚期或轉移性PCa患者的疾病進展。但這些患者的治療方法有限,預后通常較差。腫瘤轉移是導致90%癌癥相關死亡的原因,PCa是最容易發(fā)生骨轉移的人類癌癥之一,CRPC患者,特別是轉移性CRPC(mCRPC)患者能夠從ADT療中獲益有限。因此,探索PCa發(fā)生轉移的潛在途徑并尋找針對前列腺癌轉移的新的有效的生物分子靶點,以便制定更好的CRPC治療方法及腫瘤骨轉移的預防策略為近年來研究的熱點。PDLIM5(PDZ和LIM結構域蛋白5,PDZ and LIM domain protein5,PDLIM5)是由N-末端的PDZ結構域和C-末端的三個連續(xù)的LIM結構域組成的63kDa的細胞質蛋白,由Kuroda等人于1996年通過以蛋白激酶C(PKC)為誘餌蛋白的酵母雙雜交技術首次發(fā)現(xiàn)。PDLIM5可通過其PDZ結構域錨定于肌動蛋白細胞骨架并招募肌動蛋白絲相關蛋白。因此PDLIM5被認為參與細胞骨架結構組成,細胞系分化,器官發(fā)育和腫瘤形成。由于已有實驗研究證實PDLIM5的功能主要與調節(jié)突觸強度的功能有關,故大量的研究集中在PDLIM5與精神疾病如精神分裂癥和抑郁癥之間的關聯(lián)上。此外,PDLIM5被認為是細胞遷移形成板狀偽足所必需的:PDLIM5通過磷酸化調節(jié)失活后,可過滅活Rac1(Rho家族蛋白)來削弱細胞轉移能力。在腫瘤的形成和轉移方面,根據(jù)最近的研究,PDLIM5可能參與多種癌癥的發(fā)展,包括甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌及胃癌。Koutros等報道,通過使用基因芯片檢測,PDLIM5 mRNA在PCa組織中過度表達。Ma W等報道,PDLIM5可能被證明是血清和尿液分析輔助診斷的分子靶點,并且在預測晚期前列腺癌進展風險方面具有潛在價值。目前已知細胞遷移侵襲與細胞骨架的動態(tài)變化緊密相關:細胞骨架的排列,特別是含有肌動蛋白的微絲骨架重塑是決定細胞形態(tài)和運動性的關鍵因素。PDLIM5是明確的細胞骨架相關蛋白,可能在腫瘤細胞的侵襲和轉移中起著重要作用,因此了解PDLIM5在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中的分子機制將有助于改善PCa,特別是處于CRPC階段前列腺癌患者的治療方法及預后。AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)為常見的能量受體復合體,其可在缺氧,缺血再灌注,葡萄糖供給不足等應激條件過程中被激活。研究表明AMPK的激活與腫瘤生長和增殖,細胞周期,凋亡,血管形成和轉移緊密相關。在這項研究中,我們發(fā)現(xiàn)通過數(shù)據(jù)挖掘和實驗研究,PDLIM5在PCa組織中較正常前列腺組織高表達。另外,PDLIM5可以通過與AMPK結合并發(fā)揮生理功能。因此,我們利用表達短發(fā)夾RNA的慢病毒,在PC-3和DU145細胞中沉默了PDLIM5基因,觀察了癌細胞的功能表型變化,揭示了PDLIM5的PCa腫瘤發(fā)生的潛在調控機制。二、實驗目的通過研究PDLIM5在前列腺癌組織及細胞系中的表達水平,驗證PDLIM5在前列腺癌中的異常高表達。篩選高表達PDLIM5細胞株進一步進行生物功能學實驗,以探索PDLIM5介導腫瘤發(fā)生及轉移的生物學功能及調控機制。三、實驗方法(一)PDLIM5在前列腺癌相關芯片數(shù)據(jù)庫中表達分析及組織標本驗證收集Oncomine、PROGGENE數(shù)據(jù)庫中的前列腺癌樣本中PDLIM5表達、轉移及預后相關信息,驗證PDLIM5在癌和正常腺體中的表達差異,明確高表達PDLIM5與PCa轉移預后的相關性。進一步收集長征醫(yī)院泌尿外科前列腺癌根治術后臨床組織樣本44例,運用免疫組織化學染色法檢測癌和癌旁組織標本明確PDLIM5組織表達水平。(二)前列腺癌PDLIM5敲減細胞株篩選及構建與沉默效率驗證在PCa常見細胞系中通過Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表達情況,選取高表達PDLIM5的轉移性PCa細胞株DU145和PC-3作為后續(xù)實驗對象,構建包含靶向干擾PDLIM5的質粒的慢病毒進行細胞感染。觀察質粒上的報告基因熒光強度,并分別在mRNA及蛋白水平驗證PDLIM5的敲減效率,確認沉默PDLIM5的細胞株構建成功。(三)檢測PDLIM5沉默后前列腺癌細胞株增殖、細胞周期凋亡水平變化及對侵襲轉移能力影響在穩(wěn)定沉默PDLIM5的DU145和PC-3細胞中,通過MTT比色法、克隆形成試驗來評估腫瘤細胞增殖能力的變化;通過細胞流式術檢測細胞周期及凋亡水平變化以明確PDLIM5敲減后對腫瘤細胞的周期阻滯及誘導凋亡作用;通過劃痕愈合實驗及TRANSWELL實驗來檢測PDLIM5對腫瘤遷移侵襲的影響。(四)PDLIM5對前列腺癌增殖轉移調控機制的初步探究根據(jù)細胞表型相關實驗結果及數(shù)據(jù)庫信息分析,PDLIM5對腫瘤細胞的轉移侵襲能力具有顯著影響。我們首先在PDLIM5沉默狀態(tài)下通過Western Blot和qPCR對上皮細胞-間充質轉化(EMT)相關分子進行了檢測,隨后通過構建過表達質粒,在同種細胞株中過表達PDLIM5,檢測EMT相關分子表達回復情況,并分別在PDLIM5敲減及過表達兩種情況下對前列腺骨轉移相關分析因子進行檢測。最后通過免疫共沉淀,確定PDLIM5與AMPK的相互作用并對敲減PDLIM5后AMPK磷酸化水平進行檢測,探索PDLIM5-AMPK-EMT的調控機制。(五)動物實驗研究PDLIM5在體內功能作用使用沉默PDLIM5的DU145細胞進行裸鼠皮下成瘤實驗,觀察體內環(huán)境下PDLIM5敲減后對細胞成瘤及增殖能力的影響。隨后將取瘤體組織進行裂解,通過Western Blot對PDLIM5蛋白表達水平進行檢測,明確PDLIM5的沉默效率并檢測AMPK、EMT相關信號通路分子表達變化,明確在動物實驗中PDLIM5對細胞增殖轉移的調控機制。四、實驗結果1.發(fā)現(xiàn)PDLIM5在PCa組織中異常高表達,并且與PCa生化復發(fā)與生存期相關。通過免疫組化及生物信息學分析方法,確認PDLIM5在PCa中較正常前列腺組織表達水平升高,且深入分析數(shù)據(jù)庫芯片資料發(fā)現(xiàn)異常高表達的PDLIM5與預后不良因素如:轉移、高Gleason評分及TMN分期相關。同時,通過多因素分析及生存分析發(fā)現(xiàn)高表達PDLIM5是PCa生化復發(fā)的獨立危險因素并導致患者總生存率下降。2.成功建立穩(wěn)定沉默PDLIM5的DU145及PC-3細胞株,通過相關細胞學實驗發(fā)現(xiàn)沉默PDLIM5可導致前列癌細胞惡性增殖、克隆形成、侵襲轉移能力受抑制,并可誘導G2/M阻滯和細胞凋亡的發(fā)生。3.檢測PDLIM5敲減后上皮-間質轉化(EMT)相關分子表達水平,通過WesternBlot及qPCR發(fā)現(xiàn)人緊密連接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出現(xiàn)不同程度下調,而EMT關鍵分子E-cadherin表達量上升,證實EMT過程受到抑制。4.在DU145及PC-3細胞中過表達PDLIM5可以在一定程度上通過上調SNAIL的表達,從而使及關鍵分子E-cadherin表達量下降,證實PDLIM5對細胞侵襲和轉移的影響與EMT密切相關。同時在細胞實驗中檢測已知促進前列腺癌骨轉移的相關分子,如結締組織生長因子(CTGF),甲狀旁腺激素相關肽(PTHrP)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)。qPCR結果顯示,沉默PDLIM5后,PC-3細胞中這些促腫瘤轉移因子的表達顯著下調。當PDLIM5過表達時,這些分子的表達水平出現(xiàn)上調,且在DU145細胞中也觀察到類似的結果,進一步證實PDLIM5在促進腫瘤轉移中起作用5.免疫共沉淀確定PDLIM5可與AMPK相結合,敲減PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。隨后通過放線菌素阻斷上游蛋白質合成,在給藥后不同時間點檢測AMPK蛋白水平,結果發(fā)現(xiàn)PDLIM5沉默組AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通過維持AMPK的穩(wěn)定性,使AMPK通路持續(xù)性激活,從而促進前列腺癌的惡性增殖及轉移。6.裸鼠成瘤實驗證明在體內條件下,沉默PDLIM5可抑制腫瘤細胞生長。通過組織蛋白水平檢測,在動物實驗中PDLIM5同樣可通過AMPK-EMT相關通路對前列腺癌細胞增殖及轉移進行調控。五、實驗結論本研究證實了PDLIM5表達水平在PCa組織中發(fā)生上調,表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通過生物信息學分析探索PDLIM5與PCa復發(fā)和轉移的關系,表明高表達PDLIM5是前列腺癌預后不良的相關因素。此外,細胞和動物實驗都表明,PDLIM5通過激活AMPK通路可以促進癌細胞的增殖并增強EMT介導的侵襲和轉移。探索PDLIM5相關相關通路及作用靶點可能有助于豐富PCa的進展和轉移機制,并為mCRPC患者帶來新的治療策略。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25
【圖文】：

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫限定條件進行搜索，剃除DNA表達數(shù)據(jù)芯片，共有12組芯片數(shù)據(jù)中PDLIM5在前列腺癌中較正常前列腺腺體高表達，將這12例數(shù)據(jù)芯片結果進行匯總，結果如圖1所示，其中紅色代表PDLIM5在癌組織中高表達，藍色代表低表達，且顏色越深代表差異性更顯著。圖1．PDLIM5 mRNA表達水平在PCa組織中顯著升高。對ONCOMINE數(shù)據(jù)庫12個獨立數(shù)據(jù)芯片進行匯總發(fā)現(xiàn)無論單個芯片數(shù)據(jù)還是整合的薈萃分析中，PDLIM5均在前列腺癌組織中異常高表達。選取數(shù)據(jù)芯片來源如圖所示，薈萃分析統(tǒng)計量P<0.001，MedianRank：44.5。我們選取Lapointe Prostate、Luo Prostate、Welsh Prostate、Arredouani Prostate 4個芯片對PDLIM5單個表達水平進行摘錄，重新進行繪圖并統(tǒng)計分析，同樣證實PDLIM5在這個4個數(shù)據(jù)芯片中的癌組織表達水平升高，如圖2.

圖2. Oncomine數(shù)據(jù)庫中4個代表性基因芯片中的PDLIM5在PCa與正常腺體中的平比較情況。（二） 免疫組化方法在組織標本中驗證 PDLIM5 在前列腺癌腺體組織中差異表達在數(shù)據(jù)庫中，我們初步證實了PDLIM5在PCa中表達水平升高，為進一步在組織行PDLIM5的驗證，為下一步細胞學實驗打下基礎，我們利用免疫組化方法在患者組織中對PDLIM5表達水平再次驗證。經(jīng)過染色拍照評分，PDLIM5在癌及織中差異性表達結果如表一所示。

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本文編號：2722371