【摘要】：研究背景胃癌(Gastric Cancer,GC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,是世界上發(fā)病率排名第5位、死亡率排名第3位的惡性腫瘤,尤以東亞地區(qū)最高。中國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家,多數(shù)病人初診時(shí)已無(wú)法手術(shù)或發(fā)生轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。雖然目前有化療、放療、手術(shù)聯(lián)合的胃癌綜合治療,但無(wú)法手術(shù)的晚期胃癌的死亡率仍然不容樂(lè)觀。人表皮生長(zhǎng)因子受體 2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá),并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。研究表明胃癌患者中HER2過(guò)表達(dá)率從9%到23%不等,HER2在胃癌中過(guò)表達(dá)的發(fā)現(xiàn)為胃癌提供了新的靶向治療策略。曲妥珠單抗是HER2陽(yáng)性、晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌的首例靶向治療藥物。但是曲妥珠單抗的臨床獲益仍然有限,且其昂貴的成本、心臟毒性以及獲得性耐藥都限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。因此,胃癌亟需新的有效治療手段,為晚期胃癌患者探尋靶向HER2的主動(dòng)免疫治療策略具有重要的臨床意義。嵌合性抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)修飾的T細(xì)胞是近年來(lái)腫瘤免疫治療的熱點(diǎn),也是最有前景的抗腫瘤治療手段之一。表達(dá)CAR的T細(xì)胞可以通過(guò)胞外的單鏈可變結(jié)構(gòu)域(single-chain variable fragment,scFv)直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)性抗原(Tumor associated antigen,TAA),通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)激活T細(xì)胞,釋放穿孔素、顆粒酶及干擾素-γ、腫瘤壞死因子等多種細(xì)胞因子,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡壞死。因此,CART細(xì)胞的作用模式是無(wú)MHC限制性的,并且巧妙地結(jié)合了抗體特異性識(shí)別抗原的能力和T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。CART細(xì)胞療法首先在血液系統(tǒng)腫瘤中獲得了偉大的成功,此后在實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)及臨床前研究中同樣展現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)以及令人振奮的結(jié)果。與單克隆抗體治療相比,CART細(xì)胞治療具有抗腫瘤作用更持久、抗瘤譜廣、作用精準(zhǔn)、不良反應(yīng)少、耐藥風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)勢(shì)。以HER2為靶點(diǎn)的CART細(xì)胞治療已在多種腫瘤中被廣泛探究,包括乳腺癌,卵巢癌,膽管癌和胰腺癌,髓母細(xì)胞瘤,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,骨肉瘤等,部分HER2特異性的CART細(xì)胞治療已進(jìn)入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)。但是目前CART細(xì)胞對(duì)胃癌的治療潛能尚未被廣泛研究和報(bào)道。研究目的本研究旨在構(gòu)建HER2特異性的chA21 scFv-4-1BBz CAR并轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞;探究chA21 scFv-4-1BBz CART細(xì)胞在體外特異性識(shí)別和殺傷HER2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的能力,及其在體內(nèi)抑制HER2高表達(dá)的胃癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展的作用,以期為晚期胃癌提供一種新的免疫靶向治療策略。研究方法1.流式細(xì)胞儀分析人胃癌細(xì)胞株表面HER2受體的表達(dá)水平。2.應(yīng)用重疊延伸 PCR 技術(shù)(overlap extension PCR,OE-PCR)連接構(gòu)建 CD8a leader-chA21 scFv-CD8ahinge-4-1BB-CD3z 質(zhì)粒。將構(gòu)建好的 chA21-4-1BBz CARDNA接入pSin慢病毒骨架形成pSin-GFP-chA21-4-1BBz質(zhì)粒,并使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法包裝慢病毒。3.利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染chA21-4-1BBz CAR至人T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析chA21-4-1BBz CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)效率。4.通過(guò)流式多因子檢測(cè)法檢測(cè)chA21-4-1BBzCART細(xì)胞在體外與表達(dá)不同水平HER2的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)分泌Th1型(IL-2、TNF-α、INF-γ)、Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)、Th17型(IL-17A)共七種細(xì)胞因子的情況。5.設(shè)置1:1,3:1,10:1,30:1四種不同的效靶比(T細(xì)胞:腫瘤細(xì)胞),利用LDH釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)在體外chA21-4-1BBz CART細(xì)胞對(duì)不同HER2表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力。6.選擇NOD-SICD雌性小鼠背部左右兩側(cè)分別皮下接種HER2高表達(dá)的NCI-N87細(xì)胞和HER2低表達(dá)的MKN-28細(xì)胞從而建立自對(duì)照人胃癌小鼠皮下移植瘤模型;40天后分組給予chA21-4-1BBz CART細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞(Untransduced T cells,UTT cells)尾靜脈輸注治療并監(jiān)測(cè)兩組T細(xì)胞輸注對(duì)胃癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。7.T細(xì)胞治療30天后,從小鼠內(nèi)眥靜脈取血,分離小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞,行抗人CD3抗體染色。流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)估chA21-4-1BBz CAR T細(xì)胞在小鼠外周血中的生存情況。8.收集各組小鼠剝離的腫瘤,OCT包埋制備冷凍組織切片,免疫組化分析人CD3+T細(xì)胞在各組腫瘤組織內(nèi)的聚集情況,評(píng)價(jià)chA21-4-1BBz CART細(xì)胞在腫瘤位點(diǎn)的浸潤(rùn)聚集。9.選取NOD-SCID雌性小鼠腹腔內(nèi)注射N(xiāo)CI-N87細(xì)胞建立人胃癌小鼠腹膜移植瘤模型;腫瘤接種后第7、10天分組給予腹腔注射chA21-4-1BBz CAR T細(xì)胞或UTT細(xì)胞,并監(jiān)測(cè)兩組T細(xì)胞輸注對(duì)胃癌腹腔種植瘤的療效。研究結(jié)果1.人胃癌細(xì)胞系 NCI-N87 高表達(dá) HER2,HGC-27、MKN-45、BGC-823 中度表達(dá)HER2,MKN-28表達(dá)極低水平的HER2。2.成功構(gòu)建了 HER2特異性的chA21-4-1BBz CAR,慢病毒轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞后,CAR表達(dá)效率高于50%;chA21-4-1BBzCAR轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞及UTT細(xì)胞均在體外培養(yǎng)體系中擴(kuò)增良好。3.chA21-4-1BBz CAR T細(xì)胞在體外能特異性識(shí)別HER2高表達(dá)的SKOV3、NCI-N87細(xì)胞并釋放高水平的IL-2、TNF-α、INF-γ等Th1型細(xì)胞因子,對(duì)HER2中度表達(dá)的HGC-27、MKN-45、BGC-823細(xì)胞的識(shí)別及應(yīng)答能力相對(duì)較弱,而對(duì)HER2極低表達(dá)的MKN-28細(xì)胞無(wú)明顯應(yīng)答。chA21-4-1BBz CART細(xì)胞分泌的IL-2、TNF-α、INF-γ細(xì)胞因子的濃度與靶細(xì)胞表面HER2表達(dá)水平呈正相關(guān)。4.chA21-4-1BBz CAR T細(xì)胞可特異性殺傷HER2高表達(dá)的SKOV3、NCI-N87腫瘤細(xì)胞,隨著效靶比升高殺傷效率增強(qiáng),對(duì)中度表達(dá)HER2的MKN-45細(xì)胞的殺傷能力相對(duì)較弱,對(duì)HER2極低表達(dá)的MKN-28細(xì)胞無(wú)明顯殺傷作用。5.成功建立人胃癌小鼠皮下移植瘤自對(duì)照模型。相較于UTT細(xì)胞治療,chA21-4-1BBz CART細(xì)胞治療明顯抑制了 NCI-N87腫瘤的生長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),接受不同T細(xì)胞治療的MKN-28移植瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯差異(P0.05);統(tǒng)計(jì)分析各組腫瘤重量得出,chA21-4-1BBzCART細(xì)胞治療較UTT細(xì)胞治療的小鼠NCI-N87腫瘤負(fù)荷明顯減小(268 ± 50 mg vs 648 ± 18 mg,P0.001),而 MKN-28 腫瘤負(fù)荷無(wú)明顯差異(718±79mgvs 678 ±72mg,P0.05)。6.荷瘤小鼠接受T細(xì)胞治療30天后,在小鼠外周血中成功檢測(cè)到輸注的chA21-4-1BBzCART細(xì)胞的存活,但未見(jiàn)檢測(cè)到UTT細(xì)胞;免疫組化結(jié)果顯示,對(duì)于HER2高表達(dá)的NCI-N87腫瘤組織,僅有chA21-4-1BBz CART細(xì)胞治療的腫瘤病灶內(nèi)檢測(cè)到明顯的人CD3+ T細(xì)胞聚集。對(duì)于HER2極低表達(dá)的MKN-28腫瘤組織,兩組T細(xì)胞治療的腫瘤組織均未檢測(cè)到人CD3+T細(xì)胞聚集。7.成功建立人胃癌小鼠腹膜移植瘤模型,對(duì)照組UTT細(xì)胞治療的小鼠腹腔內(nèi)均觀察到血性腹水和多發(fā)腫瘤病灶;而chA21-4-1BBz CART細(xì)胞腹腔注射有效抑制了 HER2高表達(dá)的NCI-N87腹膜種植瘤的生長(zhǎng)進(jìn)展,解剖查見(jiàn)極少量的腫瘤結(jié)節(jié),無(wú)血性腹水。chA21-4-1BBzCART細(xì)胞腹腔注射明顯延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。研究結(jié)論1.chA21-4-1BBzCART細(xì)胞在體外能特異性識(shí)別HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞并釋放高水平的Th1型細(xì)胞因子,并且能特異性殺傷裂解HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。2.chA21-4-1BBz CAR T細(xì)胞靜脈輸注到小鼠體內(nèi)后可特異性識(shí)別HER2抗原,在腫瘤位點(diǎn)浸潤(rùn)聚集,有效抑制HER2高表達(dá)的胃癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)進(jìn)展,而對(duì)HER2低表達(dá)的腫瘤無(wú)明顯作用。3.chA21-4-1BBzCART細(xì)胞腹腔注射能有效抑制HER2高表達(dá)的人胃癌小鼠腹膜種植瘤的進(jìn)展并延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。4.我們構(gòu)建的HER2特異性的chA21-4-1BBz CART細(xì)胞對(duì)于HER2陽(yáng)性晚期胃癌是一種很有前景的治療手段,為下一步臨床試驗(yàn)的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。研究背景三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancers,TNBC)是一種人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2),雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)均不表達(dá)的乳腺癌,約占所有乳腺癌病理類(lèi)型的15%～20%。TNBC具有獨(dú)特的臨床及病理學(xué)特征,腫瘤異質(zhì)性很高,具有高度侵襲性,易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后很差。迄今為止仍沒(méi)有針對(duì)TNBC的標(biāo)準(zhǔn)治療,主要依賴于手術(shù)、化療和放療,臨床獲益有限,常規(guī)的內(nèi)分泌治療和靶向治療無(wú)效,亟需為T(mén)NBC患者探尋有效的治療策略。NKG2D(natural-killer group 2,member D)是 NK 細(xì)胞表面主要的活化性受體,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞上也有表達(dá),這些發(fā)現(xiàn)使其越來(lái)越成為腫瘤免疫機(jī)制的研究熱點(diǎn)。NKG2D配體(NKG2D Ligands,NKG2DLs)主要包括 MIC(MHC classI-related chain)家族的 2 個(gè)成員和 ULBP/RAET(UL16-binding protein,or retinoic acid early transcript)家族的6個(gè)成員。研究已證明了許多上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞上都有NKG2D配體的廣泛表達(dá),如三陰性乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等�？茖W(xué)家們將NKG2DL作為一種CAR T細(xì)胞治療的靶點(diǎn),已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中均取得了初步成功。早在2005年時(shí)Sentman等人已經(jīng)證明了使用CART細(xì)胞靶向NKG2DLs的可行性。他們利用全長(zhǎng)NKG2D作為胞外識(shí)別域,胞內(nèi)由Dap10提供共刺激信號(hào),鏈接CD3z構(gòu)成胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域,在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證明了 NKG2D CAR T細(xì)胞對(duì)表達(dá)NKG2DLs的腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用。后來(lái)我們課題組及其他科學(xué)家分別已經(jīng)嘗試構(gòu)建過(guò)嵌入4-1BB或CD28共刺激信號(hào)的NKG2D CAR T細(xì)胞,并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了成功。NKG2D CAR與大多數(shù)傳統(tǒng)的CAR不同的是,它使用的胞外結(jié)構(gòu)域是人NKG2D受體,而多數(shù)CAR使用的是小鼠單克隆抗體來(lái)源的scFv,因此NKG2D CAR因不攜帶任何外來(lái)種屬來(lái)源的蛋白結(jié)構(gòu),大大降低了被患者免疫系統(tǒng)排異的風(fēng)險(xiǎn)。研究報(bào)道NKG2DLs在TNBC中有廣泛表達(dá),我們推測(cè)NKG2D CART細(xì)胞療法對(duì)于TNBC可能是一種有前景的靶向治療手段,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)此方面的研究報(bào)道。研究目的本研究旨在構(gòu)建4-1BB或CD27共刺激的NKG2D CAR T細(xì)胞,探究其在體外對(duì)表達(dá)NKG2DLs的三陰性乳腺癌細(xì)胞的特異性識(shí)別和殺傷作用,及其在體內(nèi)小鼠皮下移植瘤模型中對(duì)三陰性乳腺癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展的抑制作用。同時(shí)探究共刺激信號(hào)4-1BB、CD27對(duì)NKG2DCART細(xì)胞在體內(nèi)外的擴(kuò)增及生存的作用,以期為三陰性乳腺癌提供一種新的免疫靶向治療策略。研究方法1.利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)人TNBC細(xì)胞系表面NKG2DLs的表達(dá)。2.以原有的CAR骨架為基礎(chǔ),應(yīng)用NheI和Sa11雙酶切技術(shù)連接構(gòu)建NKG2D CAR。以CD8α引導(dǎo)鏈連接人NKG2D片段(aa 82-216),以CD8α鉸鏈和跨膜區(qū)連接CD3z,或4-1BB串聯(lián)CD3z,或CD27串聯(lián)CD3z三種胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,并在CAR序列之前以2A序列連接GFP。將構(gòu)建好的GFP-CAR的DNA接入pELNS 慢病毒骨架構(gòu)建 pELNS-GFP-NKG2D-z,pELNS-GFP-NKG2D-4-1BBz,pELNS-GFP-NKG2D-CD27z質(zhì)粒,并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法制備慢病毒顆粒。3.通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染激活的人T淋巴細(xì)胞,構(gòu)建一代NKG2D-z,二代NKG2D-BBz、NKG2D-27z CAR T細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞表面CAR的表達(dá)效率。4.將三種NKG2D CAR T細(xì)胞與NKG2DLs高表達(dá)的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞共培養(yǎng),以NKG2DLs陰性的AE17細(xì)胞作對(duì)照,通過(guò)ELISA法檢測(cè)NKG2D CART細(xì)胞在體外遇到TNBC腫瘤細(xì)胞刺激后分泌INF-γ細(xì)胞因子的情況,評(píng)價(jià)其在體外特異性識(shí)別NKG2DLs陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的能力。5.設(shè)置1:2,1:1,2:1三種不同的效靶比(T淋巴細(xì)胞:腫瘤細(xì)胞),利用生物熒光細(xì)胞毒性檢測(cè)法來(lái)評(píng)價(jià)NKG2D CART細(xì)胞對(duì)表達(dá)NKG2DLs的TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用。6.設(shè)置含有或不含有外源性IL2(50 IU/ml)的體外培養(yǎng)條件,流式分析持續(xù)監(jiān)測(cè)NKG2D CAR T細(xì)胞的計(jì)數(shù)和CAR的表達(dá)水平,評(píng)價(jià)外源性IL2對(duì)NKG2D CAR T細(xì)胞在體外擴(kuò)增和CAR富集的作用。7.磁性分離篩選出CD25高表達(dá)和低表達(dá)的NKG2DCART細(xì)胞群,流式分析持續(xù)監(jiān)測(cè)NKG2D CAR T細(xì)胞的計(jì)數(shù)和CAR的表達(dá)水平,評(píng)價(jià)外源性IL2與CD25的相互作用在促進(jìn)一代NKG2D CART細(xì)胞的富集中發(fā)揮的作用。8.選擇NSG雌性小鼠皮下注射螢光素酶標(biāo)記的MDA-MB-231細(xì)胞,建立小鼠人TNBC皮下移植瘤模型;腫瘤接種第40和45天后分組給予尾靜脈注射PBS,UTT 細(xì)胞,NKG2D-z,NKG2D-BBz 或 NKG2D-27zCAR T 細(xì)胞治療,游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積并通過(guò)生物熒光成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)各組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。9.T細(xì)胞治療10天后和20天后,兩次收集小鼠外周血,流式分析輸注的人T細(xì)胞在小鼠外周血循環(huán)中的生存情況以及CD4+、CD8+T細(xì)胞的比例,同時(shí)流式分析人T細(xì)胞群組中CAR的表達(dá)情況。研究結(jié)果1.人TNBC細(xì)胞系廣泛表達(dá)NKG2DLs。MICA/B在BT549細(xì)胞表面高水平表達(dá),而在MDA-MB-436細(xì)胞表面僅低水平表達(dá)。ULBPs在TNBC細(xì)胞系中的表達(dá)水平不一:只有MDA-MB-468細(xì)胞低水平表達(dá)ULBP1,而ULBP-2/5/6在除BT549以外的TNBC細(xì)胞系中均有較高水平的表達(dá);ULBP-3和ULBP-4僅在MDA-453和MDA-MB-231上有表達(dá)。2.成功構(gòu)建了 NKG2D-zCAR、NKG2D-BBz、NKG2D-27zCAR。慢病毒轉(zhuǎn)染人T細(xì)胞后體外擴(kuò)增2周,檢測(cè)到三種CAR的表達(dá)效率均達(dá)到90%左右。3.NKG2D CAR T細(xì)胞在體外有效識(shí)別和殺傷表達(dá)NKG2DLs的TNBC細(xì)胞系并分泌高水平的IFN-γ;當(dāng)效靶比低至1:2時(shí),NKG2DCART細(xì)胞的殺傷效率超過(guò)60%,隨著效靶比的升高其殺傷效率明顯增強(qiáng),但對(duì)NKG2DLs陰性細(xì)胞系A(chǔ)E17無(wú)應(yīng)答。相較于一代的NKG2D-z CAR T細(xì)胞,二代的NKG2D-27z和NKG2D-BBz CART細(xì)胞分泌更高水平的IFN-y且表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。4.流式分析確定了未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞激活后表達(dá)NKG2DLs(～10%)。在分組給予或撤退外源性IL2的體外培養(yǎng)中,結(jié)果顯示使用含IL-2的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T細(xì)胞均擴(kuò)增良好并高度富集CAR+細(xì)胞,在第5天僅有約30%的CAR+T細(xì)胞,20天培養(yǎng)后CAR+T細(xì)胞富集到95%以上;而使用無(wú)IL-2的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T細(xì)胞均沒(méi)有有效擴(kuò)增,只有NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞高度富集CAR+ T細(xì)胞,而NKG2D-z CAR T細(xì)胞在培養(yǎng)體系中CAR+比例穩(wěn)定在～30%。說(shuō)明IL2促進(jìn)NKG2D CART細(xì)胞在體外的擴(kuò)增和富集。5.在有外源性IL-2的體外培養(yǎng)中,CD25高表達(dá)的NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CART細(xì)胞均有CAR富集至約75%～90%,而在CD25低表達(dá)的NKG2D CAR T 細(xì)胞中,二代 NKG2D-BBz 和 NKG2D-27z CAR T 細(xì)胞能達(dá)到80%～90%的CAR富集,一代NKG2D-z CAR T細(xì)胞僅有30%左右的CAR富集。說(shuō)明IL2促進(jìn)一代NKG2D CAR T細(xì)胞的富集依賴于T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)。6.以螢光素酶標(biāo)記的MDA-MB-231細(xì)胞成功建立高表達(dá)NKG2DLs的小鼠人TNBC皮下移植瘤模型。接受PBS或UTT細(xì)胞處理的小鼠MDA-MB-231腫瘤生長(zhǎng)迅速,接受NKG2D-z CART細(xì)胞治療的小鼠其腫瘤生長(zhǎng)有一定延緩,而相較于 NKG2D-z CAR T 細(xì)胞,NKG2D-BBz 或 NKG2D-27z CAR T 細(xì)胞注射表現(xiàn)出明顯更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用(P0.001)。7.第一次T細(xì)胞注射10天后,流式檢測(cè)小鼠外周血循環(huán)中人CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)高于CD8+ T細(xì)胞的計(jì)數(shù),并且NKG2D-z,NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T細(xì)胞的數(shù)量與UT T細(xì)胞數(shù)量相比明顯較少;NKG2D-BBz和NKG2D-27z CAR T細(xì)胞組中CAR的的表達(dá)率(～20%)明顯高于NKG2D-zCART細(xì)胞組中CAR的表達(dá)(～10%)。第一次T細(xì)胞注射20天后,小鼠外周循環(huán)中人CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)高于CD4+ T細(xì)胞的計(jì)數(shù),NKG2D-BBz或NKG2D-27z CAR T細(xì)胞的數(shù)量明顯增多,而UTT和NKG2D-zCART細(xì)胞數(shù)量明顯少于10天前的檢測(cè)結(jié)果;NKG2D-BBz和 NKG2D-27zCART細(xì)胞組中的 CAR 高度富集(75%-95%),明顯高于NKG2D-z CAR T細(xì)胞組中CAR的表達(dá)(～20%)。研究結(jié)論1.人TNBC細(xì)胞系廣泛表達(dá)NKG2DLs。NKG2D CART細(xì)胞在體外有效識(shí)別和殺傷表達(dá)NKG2DLs的TNBC細(xì)胞系,但對(duì)NKG2DLs陰性的細(xì)胞系無(wú)明顯應(yīng)答。相較于一代的NKG2D-z CAR T細(xì)胞,二代的NKG2D-27z和NKG2D-BBz CART細(xì)胞分泌更高水平的IFN-γ并且表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。2.外源性IL2可促進(jìn)NKG2D CART細(xì)胞在體外的擴(kuò)增和富集;二代NKG2D-BBz和NKG2D-27z CART細(xì)胞可通過(guò)共刺激信號(hào)的作用在體內(nèi)外保持良好的擴(kuò)增、存活和自我富集,而無(wú)共刺激信號(hào)的一代CART細(xì)胞的富集依賴IL2和CD25之間的相互作用。3.NKG2D CAR T細(xì)胞靜脈輸注抑制了小鼠人TNBC皮下移植瘤的生長(zhǎng),二代的NKG2D-BBz或NKG2D-27z CAR T細(xì)胞抗腫瘤作用顯著優(yōu)于一代NKG2D-z CART細(xì)胞。4.4-1BB和CD27共刺激信號(hào)可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞在體內(nèi)的存活和擴(kuò)增。4-1BB或CD27共刺激的二代NKG2D CAR T細(xì)胞在體內(nèi)能夠可有效擴(kuò)增和存活,并維持高水平CAR的表達(dá);不含共刺激信號(hào)的一代NKG2D CART細(xì)胞在體內(nèi)存活不佳,不能有效維持CAR的穩(wěn)定表達(dá)和富集。5.我們構(gòu)建的4-1BB或CD27共刺激的二代NKG2D CAR T細(xì)胞對(duì)于三陰性乳腺癌是一種很有前景的治療手段,為下一步臨床試驗(yàn)的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R730.51


本文編號(hào)：2722392