【摘要】：肺癌的發(fā)病率和死亡率高居人類惡性腫瘤榜首,且二者呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。肺癌的預(yù)后差,五年生存率低。肺癌按組織學(xué)分類可分為小細胞肺癌(Small cell lung carcinoma,SCLC)和非小細胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC),其中85%是非小細胞肺癌。非小細胞肺癌早期主要通過手術(shù)切除以達到治療的目的,晚期及轉(zhuǎn)移患者主要通過以鉑類藥物為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)全身化療手段,但其副作用嚴重,且治療效果不佳,僅能提升病人5%的五年生存率。而我國近來頻繁發(fā)生的霧霾,也必將加重我國未來肺癌的發(fā)病率和致死率,因此發(fā)展治療NSCLC的新策略迫在眉睫。近年來,以EGFR為靶標的靶向治療等療法,在晚期和轉(zhuǎn)移性肺癌產(chǎn)生了可喜的臨床療效。引發(fā)了人們對肺癌多方位作用靶點的深入研究。煙草是導(dǎo)致肺癌的重要因素,煙草中含有的尼古丁可作用于肺癌細胞上的煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR),激活下游的信號通路而促進肺癌的發(fā)生和發(fā)展。同時研究發(fā)現(xiàn),乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)除了作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)細胞中傳遞信息外,也可被非神經(jīng)細胞合成并以自分泌和旁分泌的方式釋放至細胞外液,作用于乙酰膽堿受體,參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化等基本的生物學(xué)活動,此被稱為非神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)。研究人員觀察到,包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞也可合成和分泌乙酰膽堿,同時表達nAChR(Nicotinic acetylcholine receptor,煙堿型乙酰膽堿受體)和mAChR(Muscarinic acetylcholine receptor,毒蕈堿型乙酰膽堿受體)。且外源性的乙酰膽堿受體激動劑與內(nèi)源性的ACh作用于nAChR和mAChR均能促進NSCLC細胞的生長增殖,且在腫瘤細胞中檢測到了ACh與mAChR的高表達,對此,我們推斷非神經(jīng)膽堿能系統(tǒng)是腫瘤細胞生長增殖的另一個重要的信號通路系統(tǒng)。進一步的研究顯示,在乙酰膽堿能受體的眾多亞型中,僅毒蕈堿膽堿受體3(muscarinic receptor 3,M3R)表達顯著上調(diào),且與腫瘤的預(yù)后不良高度相關(guān),且在多種腫瘤細胞中證實了M3R是AChR參與腫瘤進程的主要受體亞型,因此M3R逐漸受到關(guān)注,成為腫瘤細胞靶標研究的熱點。多個研究結(jié)果顯示,在NSCLC細胞中M3R的存在高表達現(xiàn)象,我們實驗室前期采用RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng))方法證實了在多種NSCLC細胞中,M3R mRNA存在高表達,且觀察到H1299細胞中膽堿轉(zhuǎn)移酶CHAT同樣高表達,說明NSCLC可自分泌或旁分ACh,并作用于自身的M3R而產(chǎn)生作用。因此,M3R能否成為NSCLC的新的治療靶標,有待于通過研究進一步驗證。因此,本研究以NSCLC H1299為研究對象,通過拮抗和敲除M3受體,采用SRB(Sulforhodamine B,磺酰羅丹明B)、實時無標記細胞檢測技術(shù)(Real time cellular analysis,RTCA)、流式細胞術(shù)(Flow cytoMetry,FCM)、劃痕實驗、抗體芯片及Western Blot等方法,說明了M3R在H1299細胞生長增殖和轉(zhuǎn)移中的重要地位,并進一步解釋了M3R參與H1299細胞生長增殖和轉(zhuǎn)移的分子機制。實驗結(jié)果如下:(1)本研究首先采用SRB法觀察M3R拮抗劑R2-8018【富馬酸(R,R)-戊乙奎醚】和達非那新在1.25-80μM濃度范圍內(nèi)對H1299細胞生長增殖的影響,實驗結(jié)果顯示,R2-8018和達非那新能夠濃度依賴性地抑制H1299細胞的增殖。之后我們采用RTCA方法觀察到了同樣的結(jié)果,且獲得了實時抑制曲線。(2)RTCA法觀察到外源性給予乙酰膽堿和卡巴膽堿無法促進H1299細胞的增殖。(3)FCM法測定R2-8018對H1299細胞周期時相的影響,觀察到R2-8018能夠時間和濃度依賴性地誘導(dǎo)H1299發(fā)生G_0/G_1期阻滯。(4)劃痕實驗結(jié)果顯示,拮抗M3R可使H1299細胞遷移能力顯著下降,提示M3R不僅參與了H1299細胞的增殖,同時還參與了H1299細胞的遷移。(5)采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除H1299細胞M3R基因,T7錯配酶檢測,M3R基因敲除成功。(6)RTCA法顯示與野生型H1299細胞相比,M3R敲除后H1299細胞的生長活力顯著降低。(7)RTCA法顯示外源性的激動劑乙酰膽堿和M3R拮抗劑R2-8018及達非那新對M3R敲除型H1299細胞的生長增殖無明顯影響。(8)FCM法檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)與拮抗M3R的結(jié)果一致,敲除M3R基因能夠誘導(dǎo)H1299細胞產(chǎn)生G_0/G_1期阻滯。(9)劃痕實驗結(jié)果顯示,敲除M3R可使H1299細胞遷移能力顯著下降,與拮抗M3R抑制H1299細胞遷移能力的結(jié)果相一致。(10)抗體芯片結(jié)果顯示,與野生型H1299細胞相比,敲除M3R后發(fā)現(xiàn)了磷酸化的EGFR顯著下降,且MAPK和PI3K/AKT信號通路中幾個關(guān)鍵蛋白發(fā)生了顯著的變化。提示我們拮抗和敲除M3R很有可能是通過降低EGFR磷酸化,抑制MAPK和PI3K/AKT激活,從而抑制H1299細胞生長增殖。(11)通過Western Blot進一步研究顯示,通過R2-8018拮抗和敲除M3R能夠有效抑制PKC和EGFR蛋白的表達以及MEK/ERK1/2和PI3K/AKT通路的活性,而對P38MAPK影響較小,因此我們認為拮抗和敲除M3R主要通過EGFR/MEK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT來發(fā)揮作用。(12)通過Western Blot觀察調(diào)控細胞周期的相關(guān)蛋白表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)R2-8018拮抗以及敲除M3R對細胞多個細胞周期蛋白(Cyclin)和周期依賴性激酶(Cell cycle dependent kinases,CDK)的抑制作用顯著,升高了細胞周期依賴性激酶抑制因子(Cell cycle dependent kinases inhibitor,CDKI)的表達,此結(jié)果很好地解釋了R2-8018作用和敲除M3R誘導(dǎo)H1299細胞發(fā)生周期阻滯的現(xiàn)象。(13)采用Western Blot方法觀察到R2-8018拮抗和敲除M3R后H1299細胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metal proteinases 2,MMP2)表達顯著降低,說明拮抗和敲除M3R可通過降低MMP2的表達,抑制H1299細胞轉(zhuǎn)移。結(jié)論:拮抗和敲除M3R能夠顯著抑制H1299細胞的生長增殖和遷移,引起H1299細胞發(fā)生G_0/G_1期阻滯。拮抗和敲除M3R能抑制EGFR的磷酸化,抑制MEK/ERK1/2及PI3K/AKT通路的激活,最終通過抑制細胞周期的進程而發(fā)揮腫瘤抑制作用,并通過降低MMP2的表達,抑制H1299細胞的遷移。本研究可為確認M3受體作為抗腫瘤靶標提供依據(jù),進一步而言,因為EGFR是非常明確的肺癌靶標,本研究可為確認M3R拮抗劑和EGFR拮抗劑聯(lián)合用藥靶向治療非小細胞肺癌提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

圖1-1 SRB法測定M3R拮抗劑R2-8018和達非那新對H1299細胞增殖的影響。以100%為參照標準。Mean ± SEM，n=4。Fig 1-1 The effect of M3R antagonist R2-8018 and Darifenacin on H1299 proliferation by SRB. The valueare compared with 100%. Mean ± SEM, n=4.1.2 采用實時無標記細胞檢測技術(shù)檢測M3R拮抗劑達非那新對H1299細胞生長增殖的影響，結(jié)果顯示R2-8018和達非那新均能抑制H1299細胞的增殖

0255035對H1299細胞生長增殖的影響，結(jié)果未顯示VU 0255035對抑制H1299細胞增殖的抑制作用。圖1-3 實時無標記細胞檢測技術(shù)（RTCA）監(jiān)測M1R 拮抗劑VU 0255035對H1299細胞增殖的影響。Mean ± SEM，n=3。Fig 1-3 The effect of M1R antagonist VU on H1299 proliferation by RTCA. Mean ± SEM，n=3.1.3.3 外源性激動劑乙酰膽堿和卡巴膽堿對H1299細胞增殖無明顯影響采用RTCA技術(shù)檢測外源性膽堿能受體激動劑對非小細胞肺癌細胞H1299生長增殖的作用，首先對處于對數(shù)生長期的H1299細胞給予200 μM乙酰膽堿，未觀察到促增殖作用，24 h后再給予500 μM乙酰膽堿，仍未檢測到促增殖作用。同時，外源性給予500 μM卡巴膽堿也未觀察到其對H1299細胞的促增殖作用。圖1-4 實時無標記細胞檢測技術(shù)（RTCA）監(jiān)測膽堿能受體激動劑乙酰膽堿和卡巴膽堿對H1299細胞增殖的影響。（A）RTCA技術(shù)監(jiān)測乙酰膽堿對H1299細胞增殖的作用曲線。（B）RTCA技術(shù)監(jiān)測卡巴

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李興玉;馬蘭芳;趙懷順;;SCS對P388細胞株生長增殖的影響[J];蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1989年01期

2 譚謙,陳曦,梁志為,鄒忠桃,周宏y=,楊定文,林子豪,趙耀忠;血小板衍化生長因子-B基因轉(zhuǎn)染對成纖維細胞生長增殖的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2004年08期

3 吳玉家,魯開化,張琳西;17-β雌二醇、孕酮對增生性瘢痕成纖維細胞生長增殖的影響[J];中國美容醫(yī)學(xué);2003年06期

4 姚曉銳;魏育林;孫逸平;;基因重組α型干擾素對人白血病細胞生長增殖的抑制作用[J];中日友好醫(yī)院學(xué)報;1992年S1期

5 ;“壞女人”為何不易得癌?[J];黑龍江科學(xué);2013年03期

6 聶躍華;尹文君;賀秋冬;楊立;;厚樸酚對視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞生長增殖的影響[J];中國科技信息;2011年15期

7 王敏,辛海霞,黃象艷;胰島素樣生長因子-1對成骨細胞生長影響的實驗研究[J];中國矯形外科雜志;2004年Z2期

8 楊力,魯開化,王強,艾玉峰;透明質(zhì)酸刺激因子對增生性瘢痕成纖維細胞生長增殖的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1999年11期

9 徐小潔;王凌雪;范忠義;丁麗華;張浩;楊智洪;李杰之;葉棋濃;;敲減人HPIP基因表達抑制細胞生長增殖[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2011年02期

10 李琳;李婷;王筱婧;徐江平;王順官;;靈芝孢子粉對HepG2細胞生長增殖和生長周期的影響[J];中藥材;2008年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 杜毓菁;凌萍;朱盛華;鄒惟瑩;楊蓓;張大雷;吳磊;鄒挺;;不同程度低鈣對BMSCs生長增殖的影響[A];中國生理學(xué)會第十屆全國青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2013年

2 姚平;李宏燁;;胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白在瘢痕疙瘩中的研究進展[A];2008年浙江省醫(yī)學(xué)美容暨整形外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

3 陳始明;陶澤璋;肖伯奎;;RNA干擾hTERT基因抑制Hep-2細胞生長增殖的實驗研究[A];湖北省抗癌協(xié)會頭頸腫瘤專業(yè)委員會第四次學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2005年

4 何承偉;梁念慈;朱振宇;何曉順;黃潔夫;馬澗泉;;IL-2Rα、β反義RNA對脾細胞生長增殖的影響[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

5 肖慧娟;江巖;齊玉梅;黃承鈺;李鳴;;硒、鋅對人食管癌細胞生長增殖的最佳作用濃度探討[A];老年營養(yǎng)研究進展與老年營養(yǎng)供餐規(guī)范研討會暨糖尿病腎病醫(yī)學(xué)營養(yǎng)治療進展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2011年

6 石松生;陳春美;楊衛(wèi)忠;王春華;王銳;金昌丹;;攜帶一氧化氮合酶反義基因重組腺相關(guān)病毒載體抑制大鼠腦膠質(zhì)瘤生長增殖的實驗研究[A];2011中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

7 相媛媛;張丙忠;張莘;林仲秋;徐國才;;雷帕霉素聯(lián)合順鉑抑制卵巢癌細胞株生長增殖效果及分子機制[A];中華醫(yī)學(xué)會第十次全國婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會議婦科腫瘤會場（婦科腫瘤學(xué)組、婦科病理學(xué)組）論文匯編[C];2012年

8 李長青;周躍;羅剛;張傳志;;仿生髓核組織工程支架材料對體外培養(yǎng)髓核細胞生長增殖的影響[A];第八屆全國脊柱脊髓損傷學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

9 何承偉;梁念慈;朱振宇;馬澗泉;;鼠白細胞介素2受體α和β鏈反義RNA抑制Con A刺激的脾細胞生長增殖的研究[A];第七屆全國生化藥理學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2000年

10 辛國華;羅旭;張友來;萬子楊;曾元臨;;改良五黃油對成纖維細胞生長增殖的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 何勇;肝細胞生長因子基因?qū)Ω渭毎鲋臣翱箵p傷能力的影響和對急性肝功能衰竭的治療作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

2 覃怡;鹽酸嗎啡對腫瘤生長增殖的影響及其分子機制的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

3 陳放;TOPK蛋白和肝癌發(fā)生以及相關(guān)調(diào)控機制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

4 張磊;Survivin對神經(jīng)母細胞瘤細胞生物學(xué)影響及其抑制劑YM155化療增敏作用研究[D];山東大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 藍麗婷;乙酰膽堿M3受體在NSCLC H1299細胞生長增殖和運動遷移中的作用及信號機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

2 呂克藺;黃芪制劑對Hela細胞生長增殖及其相關(guān)調(diào)控分子表達影響的實驗研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

3 范艷玲;Med19促進乳腺癌生長增殖的機制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

4 劉秀萍;丹參制劑對宮頸癌Hela細胞生長增殖及其相關(guān)調(diào)控分子表達影響的體外實驗研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

5 梁松;eIF4E在胃癌細胞生長增殖中作用機制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

6 段蓉;DHA對胃癌MGC-803細胞生長增殖的影響分析[D];南華大學(xué);2012年

7 李明;艱難梭菌毒素A對K562細胞生長增殖的影響[D];蘭州大學(xué);2011年

8 邱敏琦;下調(diào)wnt-2基因表達對MGC803生長增殖的影響[D];南華大學(xué);2014年

9 戴濤;HCI2509及JQ1對前列腺癌細胞系生長增殖的影響[D];南華大學(xué);2016年

10 姚旭炯;STGC3基因表達下調(diào)對NP69細胞系生長增殖的影響[D];南華大學(xué);2011年

本文編號：2719774