【摘要】：肺癌的發(fā)病率和死亡率高居人類惡性腫瘤榜首,且二者呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)。肺癌的預(yù)后差,五年生存率低。肺癌按組織學(xué)分類可分為小細(xì)胞肺癌(Small cell lung carcinoma,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC),其中85%是非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌早期主要通過(guò)手術(shù)切除以達(dá)到治療的目的,晚期及轉(zhuǎn)移患者主要通過(guò)以鉑類藥物為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)全身化療手段,但其副作用嚴(yán)重,且治療效果不佳,僅能提升病人5%的五年生存率。而我國(guó)近來(lái)頻繁發(fā)生的霧霾,也必將加重我國(guó)未來(lái)肺癌的發(fā)病率和致死率,因此發(fā)展治療NSCLC的新策略迫在眉睫。近年來(lái),以EGFR為靶標(biāo)的靶向治療等療法,在晚期和轉(zhuǎn)移性肺癌產(chǎn)生了可喜的臨床療效。引發(fā)了人們對(duì)肺癌多方位作用靶點(diǎn)的深入研究。煙草是導(dǎo)致肺癌的重要因素,煙草中含有的尼古丁可作用于肺癌細(xì)胞上的煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR),激活下游的信號(hào)通路而促進(jìn)肺癌的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)除了作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞中傳遞信息外,也可被非神經(jīng)細(xì)胞合成并以自分泌和旁分泌的方式釋放至細(xì)胞外液,作用于乙酰膽堿受體,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等基本的生物學(xué)活動(dòng),此被稱為非神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)。研究人員觀察到,包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞也可合成和分泌乙酰膽堿,同時(shí)表達(dá)nAChR(Nicotinic acetylcholine receptor,煙堿型乙酰膽堿受體)和mAChR(Muscarinic acetylcholine receptor,毒蕈堿型乙酰膽堿受體)。且外源性的乙酰膽堿受體激動(dòng)劑與內(nèi)源性的ACh作用于nAChR和mAChR均能促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,且在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了ACh與mAChR的高表達(dá),對(duì)此,我們推斷非神經(jīng)膽堿能系統(tǒng)是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的另一個(gè)重要的信號(hào)通路系統(tǒng)。進(jìn)一步的研究顯示,在乙酰膽堿能受體的眾多亞型中,僅毒蕈堿膽堿受體3(muscarinic receptor 3,M3R)表達(dá)顯著上調(diào),且與腫瘤的預(yù)后不良高度相關(guān),且在多種腫瘤細(xì)胞中證實(shí)了M3R是AChR參與腫瘤進(jìn)程的主要受體亞型,因此M3R逐漸受到關(guān)注,成為腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)研究的熱點(diǎn)。多個(gè)研究結(jié)果顯示,在NSCLC細(xì)胞中M3R的存在高表達(dá)現(xiàn)象,我們實(shí)驗(yàn)室前期采用RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法證實(shí)了在多種NSCLC細(xì)胞中,M3R mRNA存在高表達(dá),且觀察到H1299細(xì)胞中膽堿轉(zhuǎn)移酶CHAT同樣高表達(dá),說(shuō)明NSCLC可自分泌或旁分ACh,并作用于自身的M3R而產(chǎn)生作用。因此,M3R能否成為NSCLC的新的治療靶標(biāo),有待于通過(guò)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。因此,本研究以NSCLC H1299為研究對(duì)象,通過(guò)拮抗和敲除M3受體,采用SRB(Sulforhodamine B,磺酰羅丹明B)、實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(Real time cellular analysis,RTCA)、流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytoMetry,FCM)、劃痕實(shí)驗(yàn)、抗體芯片及Western Blot等方法,說(shuō)明了M3R在H1299細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和轉(zhuǎn)移中的重要地位,并進(jìn)一步解釋了M3R參與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)本研究首先采用SRB法觀察M3R拮抗劑R2-8018【富馬酸(R,R)-戊乙奎醚】和達(dá)非那新在1.25-80μM濃度范圍內(nèi)對(duì)H1299細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,R2-8018和達(dá)非那新能夠濃度依賴性地抑制H1299細(xì)胞的增殖。之后我們采用RTCA方法觀察到了同樣的結(jié)果,且獲得了實(shí)時(shí)抑制曲線。(2)RTCA法觀察到外源性給予乙酰膽堿和卡巴膽堿無(wú)法促進(jìn)H1299細(xì)胞的增殖。(3)FCM法測(cè)定R2-8018對(duì)H1299細(xì)胞周期時(shí)相的影響,觀察到R2-8018能夠時(shí)間和濃度依賴性地誘導(dǎo)H1299發(fā)生G_0/G_1期阻滯。(4)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,拮抗M3R可使H1299細(xì)胞遷移能力顯著下降,提示M3R不僅參與了H1299細(xì)胞的增殖,同時(shí)還參與了H1299細(xì)胞的遷移。(5)采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除H1299細(xì)胞M3R基因,T7錯(cuò)配酶檢測(cè),M3R基因敲除成功。(6)RTCA法顯示與野生型H1299細(xì)胞相比,M3R敲除后H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)活力顯著降低。(7)RTCA法顯示外源性的激動(dòng)劑乙酰膽堿和M3R拮抗劑R2-8018及達(dá)非那新對(duì)M3R敲除型H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖無(wú)明顯影響。(8)FCM法檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)與拮抗M3R的結(jié)果一致,敲除M3R基因能夠誘導(dǎo)H1299細(xì)胞產(chǎn)生G_0/G_1期阻滯。(9)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除M3R可使H1299細(xì)胞遷移能力顯著下降,與拮抗M3R抑制H1299細(xì)胞遷移能力的結(jié)果相一致。(10)抗體芯片結(jié)果顯示,與野生型H1299細(xì)胞相比,敲除M3R后發(fā)現(xiàn)了磷酸化的EGFR顯著下降,且MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵蛋白發(fā)生了顯著的變化。提示我們拮抗和敲除M3R很有可能是通過(guò)降低EGFR磷酸化,抑制MAPK和PI3K/AKT激活,從而抑制H1299細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。(11)通過(guò)Western Blot進(jìn)一步研究顯示,通過(guò)R2-8018拮抗和敲除M3R能夠有效抑制PKC和EGFR蛋白的表達(dá)以及MEK/ERK1/2和PI3K/AKT通路的活性,而對(duì)P38MAPK影響較小,因此我們認(rèn)為拮抗和敲除M3R主要通過(guò)EGFR/MEK/ERK1/2和EGFR/PI3K/AKT來(lái)發(fā)揮作用。(12)通過(guò)Western Blot觀察調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)R2-8018拮抗以及敲除M3R對(duì)細(xì)胞多個(gè)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)和周期依賴性激酶(Cell cycle dependent kinases,CDK)的抑制作用顯著,升高了細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子(Cell cycle dependent kinases inhibitor,CDKI)的表達(dá),此結(jié)果很好地解釋了R2-8018作用和敲除M3R誘導(dǎo)H1299細(xì)胞發(fā)生周期阻滯的現(xiàn)象。(13)采用Western Blot方法觀察到R2-8018拮抗和敲除M3R后H1299細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metal proteinases 2,MMP2)表達(dá)顯著降低,說(shuō)明拮抗和敲除M3R可通過(guò)降低MMP2的表達(dá),抑制H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)移。結(jié)論:拮抗和敲除M3R能夠顯著抑制H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和遷移,引起H1299細(xì)胞發(fā)生G_0/G_1期阻滯。拮抗和敲除M3R能抑制EGFR的磷酸化,抑制MEK/ERK1/2及PI3K/AKT通路的激活,最終通過(guò)抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程而發(fā)揮腫瘤抑制作用,并通過(guò)降低MMP2的表達(dá),抑制H1299細(xì)胞的遷移。本研究可為確認(rèn)M3受體作為抗腫瘤靶標(biāo)提供依據(jù),進(jìn)一步而言,因?yàn)镋GFR是非常明確的肺癌靶標(biāo),本研究可為確認(rèn)M3R拮抗劑和EGFR拮抗劑聯(lián)合用藥靶向治療非小細(xì)胞肺癌提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2
【圖文】：

圖1-1 SRB法測(cè)定M3R拮抗劑R2-8018和達(dá)非那新對(duì)H1299細(xì)胞增殖的影響。以100%為參照標(biāo)準(zhǔn)。Mean ± SEM，n=4。Fig 1-1 The effect of M3R antagonist R2-8018 and Darifenacin on H1299 proliferation by SRB. The valueare compared with 100%. Mean ± SEM, n=4.1.2 采用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)M3R拮抗劑達(dá)非那新對(duì)H1299細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，結(jié)果顯示R2-8018和達(dá)非那新均能抑制H1299細(xì)胞的增殖

0255035對(duì)H1299細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，結(jié)果未顯示VU 0255035對(duì)抑制H1299細(xì)胞增殖的抑制作用。圖1-3 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)（RTCA）監(jiān)測(cè)M1R 拮抗劑VU 0255035對(duì)H1299細(xì)胞增殖的影響。Mean ± SEM，n=3。Fig 1-3 The effect of M1R antagonist VU on H1299 proliferation by RTCA. Mean ± SEM，n=3.1.3.3 外源性激動(dòng)劑乙酰膽堿和卡巴膽堿對(duì)H1299細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響采用RTCA技術(shù)檢測(cè)外源性膽堿能受體激動(dòng)劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299生長(zhǎng)增殖的作用，首先對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞給予200 μM乙酰膽堿，未觀察到促增殖作用，24 h后再給予500 μM乙酰膽堿，仍未檢測(cè)到促增殖作用。同時(shí)，外源性給予500 μM卡巴膽堿也未觀察到其對(duì)H1299細(xì)胞的促增殖作用。圖1-4 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)（RTCA）監(jiān)測(cè)膽堿能受體激動(dòng)劑乙酰膽堿和卡巴膽堿對(duì)H1299細(xì)胞增殖的影響。（A）RTCA技術(shù)監(jiān)測(cè)乙酰膽堿對(duì)H1299細(xì)胞增殖的作用曲線。（B）RTCA技術(shù)監(jiān)測(cè)卡巴

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本文編號(hào)：2719774