【摘要】：研究背景:乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅女性生命健康。我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前,以手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放化療為主的綜合治療方法已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。然而,由于乳腺癌具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、高侵襲性、化療耐藥性及特殊的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境等不良特征,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍然是影響乳腺癌生存率和死亡率的主要原因。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是由腫瘤實(shí)質(zhì)和間質(zhì)兩部分組成,浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞群、局部表達(dá)的獨(dú)特細(xì)胞因子和趨化因子等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及免疫逃逸過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。文獻(xiàn)報(bào)道,腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抑制性因子可與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞相互作用而調(diào)控腫瘤的免疫逃逸。因此,深入探索乳腺腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的相互作用及腫瘤免疫逃逸機(jī)制已成為目前乳腺癌研究的熱點(diǎn)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前已知最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞,處于調(diào)節(jié)和維持機(jī)體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。CD83是人DC細(xì)胞成熟的標(biāo)志,同時(shí)成熟DC細(xì)胞還高表達(dá)HLA-DR、CD40、共刺激分子CD80和CD86等。正常情況下,成熟DC細(xì)胞能有效的捕獲、處理抗原并將抗原遞呈給特異性T淋巴細(xì)胞,激活特異性免疫應(yīng)答,維持自身的功能穩(wěn)定。機(jī)體抗腫瘤免疫主要由成熟DC細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的其他免疫細(xì)胞共同介導(dǎo)。成熟DC細(xì)胞作用下的初始T細(xì)胞極化方向和CD8+T細(xì)胞的活化是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵,對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫至關(guān)重要。在腫瘤局部微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞可與DC細(xì)胞直接接觸,通過某種未知的方式和途徑影響DC細(xì)胞功能,抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫。本課題旨在研究乳腺腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)抑制性分子CTLA-4及分泌抑制性細(xì)胞因子IL-35對(duì)腫瘤微環(huán)境中DC細(xì)胞成熟及免疫學(xué)功能的影響;以及在低氧饑餓的惡劣腫瘤微環(huán)境中,乳腺腫瘤細(xì)胞通過自分泌和旁分泌IL-35對(duì)自身增殖、凋亡、自噬等多種惡性生物學(xué)行為的影響及其可能的機(jī)制。我們的研究為更深入了解腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中免疫細(xì)胞的相互作用提供了有價(jià)值的補(bǔ)充,有助于從微環(huán)境為基礎(chǔ)的創(chuàng)新角度入手,闡述腫瘤進(jìn)展和腫瘤免疫逃逸的相關(guān)機(jī)制。同時(shí),也為乳腺腫瘤的生物治療和免疫治療提供了全新的思路和治療策略,具有重要的理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。第一部分CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞抑制樹突狀細(xì)胞的成熟和功能目的:細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4),是重要的免疫抑制性受體,主要表達(dá)于效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)。Treg細(xì)胞表面的CTLA-4能與DC細(xì)胞表面分子B7結(jié)合,通過抑制T細(xì)胞增殖活化、阻斷細(xì)胞周期演進(jìn)、降低炎性細(xì)胞因子的分泌來發(fā)揮免疫抑制作用。目前已在許多類型腫瘤中發(fā)現(xiàn)CTLA-4的表達(dá),如乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、骨肉瘤等。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),乳腺癌細(xì)胞也可表達(dá)CTLA-4,且CTLA-4的表達(dá)與腫瘤的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而迄今為止,CTLA-4在乳腺癌組織中表達(dá)的意義尚不明確。表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞表面的CTLA-4是否與Treg細(xì)胞表面的CTLA-4具有相似的功能?CTLA-4陽性表達(dá)對(duì)腫瘤微環(huán)境中DC細(xì)胞的成熟和免疫學(xué)功能有何影響?CTLA-4功能性抗體對(duì)CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞自身的惡性生物學(xué)行為是否有直接作用?為回答以上問題,本部分研究將建立CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞與單核細(xì)胞來源的DC細(xì)胞共培養(yǎng)體系來模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境,分析CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞對(duì)DC細(xì)胞成熟和功能的影響,包括DC細(xì)胞的成熟表型和細(xì)胞因子分泌水平,共培養(yǎng)后的DC細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的能力、誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞極化的能力和方向、對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的影響及其分子信號(hào)通路,并同時(shí)探討了 CTLA-4功能性抗體治療對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞自身生物學(xué)行為的影響。方法:1.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞表面及胞內(nèi)CTLA-4的表達(dá)并篩選出CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞。2.利用人外周血單核細(xì)胞來源DC細(xì)胞與CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系。采用流式細(xì)胞術(shù)、液相懸浮芯片等技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞對(duì)DC細(xì)胞成熟表型和細(xì)胞因子分泌水平的影響。3.將CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞處理后的DC細(xì)胞與CD4+/CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng),利用CCK-8方法檢測(cè)CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞處理后的DC細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。4.將CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞處理后的DC細(xì)胞與初始CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng),采用流式細(xì)胞術(shù)和液相懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞處理后的DC細(xì)胞對(duì)初始CD4+T細(xì)胞極化、CD8+細(xì)胞殺傷能力的影響。5.采用western blotting方法檢測(cè)CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞影響DC細(xì)胞成熟的相關(guān)信號(hào)通路。6.利用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)檢測(cè)CTLA-4功能性抗體對(duì)CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果:1.流式細(xì)胞術(shù)顯示CTLA-4在乳腺腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),且胞內(nèi)表達(dá)高于胞膜表達(dá)。2.CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞抑制了 DC細(xì)胞的表型成熟,主要表現(xiàn)在CD83、CD40、CD80、CD86和HLA-DR表達(dá)的下調(diào)。但在阻斷CTLA-4后,DC細(xì)胞的表面標(biāo)志有不同程度的升高,且細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-12和TNF-α的分泌水平也顯著提高。3.CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞處理的DC細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+/CD8+T細(xì)胞增殖的能力明顯減弱。4.CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞處理的DC細(xì)胞抑制CD4+初始T細(xì)胞向Th1方向極化,但對(duì)Th2的極化無明顯影響,主要表現(xiàn)在CD4+IFN-γ+T細(xì)胞比例明顯降低,Th1型細(xì)胞因子(IL-1β、IFN-y和TNF-α)的分泌水平改變。5.CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞處理的DC細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞顆粒酶B的產(chǎn)生和細(xì)胞因子的分泌。6.CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞抑制DC細(xì)胞成熟和功能是通過異常的激活ERK和STAT3通路來實(shí)現(xiàn)。7.CTLA-4功能性抗體可直接抑制CTLA-4+乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,但對(duì)細(xì)胞周期無明顯作用。結(jié)論:我們的研究首次證實(shí)了乳腺腫瘤細(xì)胞表面的抑制性分子CTLA-4可以直接作用于腫瘤微環(huán)境中的DC細(xì)胞,通過抑制DC細(xì)胞的成熟和功能來達(dá)到腫瘤的免疫逃逸,而阻斷CTLA-4可以恢復(fù)DC細(xì)胞活性,并直接抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究揭示了乳腺腫瘤患者免疫功能低下的根本原因,也為腫瘤免疫學(xué)及腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)和臨床研究提供了新思路和線索,為后續(xù)的抗腫瘤治療研究提供了新靶點(diǎn)。第二部分在低氧饑餓狀態(tài)下腫瘤源性IL-35通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的存活目的:自噬(autophagy)是一種通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)容物降解和再利用來滿足細(xì)胞自身代謝需要的過程。這種能量再利用的特殊生存機(jī)制在維持細(xì)胞自我修復(fù)、正常運(yùn)轉(zhuǎn)和逃避惡劣環(huán)境(如炎癥、低氧、饑餓等)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí),自噬作為一種新型的細(xì)胞死亡機(jī)制,與凋亡存在密切聯(lián)系,即在一定程度上細(xì)胞可以通過增強(qiáng)自噬來避免凋亡,幫助細(xì)胞抵抗惡劣生存環(huán)境。乳腺癌是一個(gè)典型的實(shí)體性腫瘤,隨著腫瘤細(xì)胞的無限制增殖,腫瘤內(nèi)部存在廣泛的低氧缺血區(qū)域。因此,乳腺癌組織中存在著廣泛的自噬激活現(xiàn)象,顯著增強(qiáng)了其對(duì)缺氧營(yíng)養(yǎng)貧瘠的耐受能力。IL-35是近年來新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制性細(xì)胞因子,屬于IL-12細(xì)胞因子家族,由EB病毒誘導(dǎo)的基因 3(Epstein-Barr Virus Induced Gene 3,EBI3)和 IL-12α 亞基p35以異二聚體的形式組成。除Treg和Breg外,IL-35也可表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞,如肺癌、直腸癌、胰腺癌中,且參與腫瘤的發(fā)生演進(jìn)。我們前期研究及本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-35不僅高表達(dá)于乳腺癌組織的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中,也在乳腺腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá),且IL-35可以促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖,對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用,同時(shí)低氧饑餓(hypoxia and serum deprivation,H/SD)狀態(tài)下乳腺腫瘤細(xì)胞表面IL-35的受體表達(dá)明顯上調(diào)。但I(xiàn)L-35是否在低氧饑餓狀態(tài)下對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用?IL-35是否參與低氧饑餓狀態(tài)下乳腺腫瘤細(xì)胞的自噬?目前尚無報(bào)道。本部分旨在研究低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞自噬水平的影響及其相關(guān)信號(hào)通路;低氧饑餓狀態(tài)下IL-35介導(dǎo)的乳腺腫瘤細(xì)胞自噬改變對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡水平的影響。方法:1.利用免疫組化和免疫熒光染色方法檢測(cè)乳腺癌組織和細(xì)胞中IL-35的表達(dá),同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在正常和低氧饑餓狀態(tài)下乳腺腫瘤細(xì)胞表面IL-35受體的表達(dá)。2.采用CCK-8、細(xì)胞周期檢測(cè)、凋亡檢測(cè)和western blotting等方法檢測(cè)在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。3.采用MDC染色和western blotting方法檢測(cè)在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞自噬的影響。4.選用自噬抑制劑3-MA和Baf-AI,通過CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)阻斷自噬后IL-35對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。5.利用western blotting方法檢測(cè)在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)分子信號(hào)通路的影響。結(jié)果:1.通過免疫組化和免疫熒光染色顯示乳腺癌組織和細(xì)胞均表達(dá)IL-35的兩個(gè)亞基EB13和1L-12p35,且存在共定位效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示乳腺腫瘤細(xì)胞表達(dá)IL-35受體,且低氧饑餓狀態(tài)下的IL-35受體表達(dá)上調(diào)。2.在低氧饑餓狀態(tài)下,IL-35促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖,逆轉(zhuǎn)低氧饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞周期G1期阻滯,抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的凋亡,上調(diào)cyclinD1、cyclinE1、CDK2和Bcl-2蛋白的表達(dá),下調(diào)p27、Bax和cleaved caspase3蛋白的表達(dá),且呈劑量依賴性。3.IL-35在低氧饑餓狀態(tài)下促進(jìn)了乳腺腫瘤細(xì)胞的自噬。利用自噬抑制劑3-MA和Baf-A1阻斷自噬后,IL-35對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用明顯減弱,表現(xiàn)為細(xì)胞增殖受抑制,凋亡比例增加。4.western blotting結(jié)果表明,在低氧饑餓狀態(tài)下,IL-35可通過下調(diào)乳腺腫瘤細(xì)胞中p-mTOR、p-AKT和PI3K的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬。結(jié)論:在本部分研究中,我們證實(shí)了 IL-35可組成性、高水平表達(dá)于乳腺癌組織和細(xì)胞中,并首次證明,在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35可通過抑制mTOR/AKT/PI3K信號(hào)通路而誘導(dǎo)乳腺腫瘤細(xì)胞自噬,從而促進(jìn)其增殖、抑制其凋亡。本研究首次報(bào)道了這種IL-35促進(jìn)實(shí)性乳腺腫瘤惡性演進(jìn)的新機(jī)制,并為乳腺腫瘤的輔助治療提供了全新的治療靶點(diǎn)。第三部分 IL-35抑制樹突狀細(xì)胞的成熟和功能目的:IL-35作為一種重要的抑制性細(xì)胞因子,其免疫抑制功能已很明確,不僅能夠直接抑制效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞因子的分泌,抑制Th17細(xì)胞的極化和細(xì)胞因子IL-17的產(chǎn)生,促進(jìn)Treg的增殖。此外,IL-35還能誘導(dǎo)初始T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成分泌IL-35的Treg(IL-35 induced regulatory T cell,iTr35),從而級(jí)聯(lián)放大Treg的免疫調(diào)節(jié)作用。腫瘤源性IL-35可通過募集髓系來源抑制性細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管形成,進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和抑制機(jī)體抗腫瘤免疫。我們?cè)谇捌谘芯亢捅狙芯恐邪l(fā)現(xiàn),IL-35在乳腺腫瘤組織和腫瘤浸潤(rùn)性淋巴組織中高表達(dá),且其表達(dá)的水平與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是,目前關(guān)于IL-35對(duì)于腫瘤微環(huán)境中DC細(xì)胞的影響尚未報(bào)道。本研究利用外源性IL-35替代腫瘤自分泌或旁分泌的IL-35作用于人外周血單核細(xì)胞來源DC細(xì)胞來模擬腫瘤微環(huán)境中IL-35對(duì)DC細(xì)胞作用的體外模型,觀察IL-35對(duì)DC細(xì)胞分化、成熟和免疫學(xué)功能的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。方法:1.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC細(xì)胞中IL-35及其受體的表達(dá)。2.將IL-35分別作用于DC細(xì)胞分化或成熟階段,利用流式細(xì)胞術(shù)和液相懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)IL-35對(duì)DC細(xì)胞表型和細(xì)胞因子分泌的影響。3.建立IL-35處理的DC細(xì)胞與CD4+/CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系,利用CCK-8技術(shù)檢測(cè)IL-35處理的DC細(xì)胞對(duì)不同T淋巴細(xì)胞亞群增殖能力的影響。4.將IL-35處理的DC細(xì)胞與初始CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng),采用流式細(xì)胞術(shù)和液相懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)IL-35處理的DC細(xì)胞對(duì)初始CD4+T細(xì)胞極化、CD8+細(xì)胞功能的影響。5.利用western blotting方法檢測(cè)IL-35影響DC細(xì)胞成熟和功能的相關(guān)信號(hào)通路。結(jié)果:I.DC細(xì)胞本身不能分泌IL-35且外源性IL-35亦不能誘導(dǎo)DC細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-35,但是CD14+單核細(xì)胞和DC細(xì)胞均有IL-35受體的表達(dá)。2.IL-35部分抑制DC細(xì)胞的分化,主要表現(xiàn)在分化標(biāo)志性表型CD1a和CD209的表達(dá)部分下調(diào)。3.IL-35顯著抑制DC細(xì)胞的表型成熟和細(xì)胞因子的分泌,主要表現(xiàn)為HLA-DR、CD40、CD80、CD86、CD83 的表達(dá)下調(diào)和細(xì)胞因子 IL-1β、IL-2、IL-12p70、IFN-y和TNF-α分泌水平降低。4.與正常對(duì)照組DC細(xì)胞相比,IL-35處理的DC細(xì)胞顯著抑制CD4+/CD8+T細(xì)胞的增殖,限制初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞極化和CD8+T細(xì)胞的殺傷能力。5.IL-35主要是通過異常激活STAT1/STAT3和抑制p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路來抑制DC細(xì)胞的成熟和功能。結(jié)論:在本研究中,我們首次證明,除作用于T細(xì)胞和B細(xì)胞外,IL-35也可抑制DC細(xì)胞的功能,其作用主要表現(xiàn)為抑制DC細(xì)胞的成熟,而這種成熟能力受限的DC細(xì)胞可進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的增殖,并降低初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞的極化和CD8+T細(xì)胞的殺傷功能,從而進(jìn)一步降低機(jī)體的特異性免疫。IL-35對(duì)DC細(xì)胞功能的抑制主要是通過異常激活STAT1/STAT3和抑制p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。本課題為腫瘤的免疫逃逸機(jī)制研究提供了有力的補(bǔ)充,提示IL-35在腫瘤的發(fā)生演進(jìn)中發(fā)揮著重要作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9
【圖文】：

圖１－１：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ＣＴＬＡ－４在乳腺腫瘤細(xì)胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和ＭＣＦ－７）逡逑中的表達(dá)情況。（左）顯示乳腺腫瘤細(xì)胞胞膜的ＣＴＬＡ－４表達(dá)；（右）顯示逡逑乳腺腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)的ＣＴＬＡ－４表達(dá)，同時(shí)選用相應(yīng)的同型對(duì)照做對(duì)比。逡逑

邐ＰＬ？－＾邐Ｆｌｌ邋Ｈ逡逑圖１－２：邋ＣＴＬＡ－４＋乳腺腫瘤細(xì)胞對(duì)ＤＣ細(xì)胞成熟表型的影響。將ＣＴＬＡ－４＋逡逑乳腺腫瘤細(xì)胞系與人外周血中．核細(xì)胞來源Ｄ邋Ｃ細(xì)胞按１邋：１的比例共培YM４邋８邋ｈ

本文編號(hào)：2719632