發(fā)布時間：2020-06-18 18:03

【摘要】：研究背景:乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一,嚴重威脅女性生命健康。我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。目前,以手術治療、內分泌治療、放化療為主的綜合治療方法已取得了長足的進步。然而,由于乳腺癌具有浸潤性生長、高侵襲性、化療耐藥性及特殊的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境等不良特征,復發(fā)轉移仍然是影響乳腺癌生存率和死亡率的主要原因。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是由腫瘤實質和間質兩部分組成,浸潤的免疫細胞群、局部表達的獨特細胞因子和趨化因子等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉移及免疫逃逸過程中發(fā)揮著至關重要的作用。文獻報道,腫瘤細胞表達的抑制性因子可與腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞相互作用而調控腫瘤的免疫逃逸。因此,深入探索乳腺腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的相互作用及腫瘤免疫逃逸機制已成為目前乳腺癌研究的熱點。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前已知最強大的抗原遞呈細胞,處于調節(jié)和維持機體免疫應答的中心環(huán)節(jié)。CD83是人DC細胞成熟的標志,同時成熟DC細胞還高表達HLA-DR、CD40、共刺激分子CD80和CD86等。正常情況下,成熟DC細胞能有效的捕獲、處理抗原并將抗原遞呈給特異性T淋巴細胞,激活特異性免疫應答,維持自身的功能穩(wěn)定。機體抗腫瘤免疫主要由成熟DC細胞和腫瘤微環(huán)境中的其他免疫細胞共同介導。成熟DC細胞作用下的初始T細胞極化方向和CD8+T細胞的活化是調節(jié)免疫應答的關鍵,對機體抗腫瘤免疫至關重要。在腫瘤局部微環(huán)境中,腫瘤細胞可與DC細胞直接接觸,通過某種未知的方式和途徑影響DC細胞功能,抑制機體的抗腫瘤免疫。本課題旨在研究乳腺腫瘤細胞通過表達抑制性分子CTLA-4及分泌抑制性細胞因子IL-35對腫瘤微環(huán)境中DC細胞成熟及免疫學功能的影響;以及在低氧饑餓的惡劣腫瘤微環(huán)境中,乳腺腫瘤細胞通過自分泌和旁分泌IL-35對自身增殖、凋亡、自噬等多種惡性生物學行為的影響及其可能的機制。我們的研究為更深入了解腫瘤細胞與微環(huán)境中免疫細胞的相互作用提供了有價值的補充,有助于從微環(huán)境為基礎的創(chuàng)新角度入手,闡述腫瘤進展和腫瘤免疫逃逸的相關機制。同時,也為乳腺腫瘤的生物治療和免疫治療提供了全新的思路和治療策略,具有重要的理論價值和廣闊的應用前景。第一部分CTLA-4+乳腺腫瘤細胞抑制樹突狀細胞的成熟和功能目的:細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4),是重要的免疫抑制性受體,主要表達于效應性T細胞和調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)。Treg細胞表面的CTLA-4能與DC細胞表面分子B7結合,通過抑制T細胞增殖活化、阻斷細胞周期演進、降低炎性細胞因子的分泌來發(fā)揮免疫抑制作用。目前已在許多類型腫瘤中發(fā)現(xiàn)CTLA-4的表達,如乳腺癌、結腸癌、腎癌、骨肉瘤等。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),乳腺癌細胞也可表達CTLA-4,且CTLA-4的表達與腫瘤的臨床分期和淋巴結轉移密切相關。然而迄今為止,CTLA-4在乳腺癌組織中表達的意義尚不明確。表達于乳腺癌細胞表面的CTLA-4是否與Treg細胞表面的CTLA-4具有相似的功能?CTLA-4陽性表達對腫瘤微環(huán)境中DC細胞的成熟和免疫學功能有何影響?CTLA-4功能性抗體對CTLA-4+乳腺腫瘤細胞自身的惡性生物學行為是否有直接作用?為回答以上問題,本部分研究將建立CTLA-4+乳腺腫瘤細胞與單核細胞來源的DC細胞共培養(yǎng)體系來模擬體內腫瘤微環(huán)境,分析CTLA-4+乳腺腫瘤細胞對DC細胞成熟和功能的影響,包括DC細胞的成熟表型和細胞因子分泌水平,共培養(yǎng)后的DC細胞刺激T細胞增殖的能力、誘導初始CD4+T細胞極化的能力和方向、對CD8+T細胞功能的影響及其分子信號通路,并同時探討了 CTLA-4功能性抗體治療對乳腺腫瘤細胞自身生物學行為的影響。方法:1.通過流式細胞術檢測乳腺癌細胞表面及胞內CTLA-4的表達并篩選出CTLA-4+乳腺腫瘤細胞。2.利用人外周血單核細胞來源DC細胞與CTLA-4+乳腺腫瘤細胞建立共培養(yǎng)體系。采用流式細胞術、液相懸浮芯片等技術檢測共培養(yǎng)體系中CTLA-4+乳腺腫瘤細胞對DC細胞成熟表型和細胞因子分泌水平的影響。3.將CTLA-4+乳腺腫瘤細胞處理后的DC細胞與CD4+/CD8+T細胞共培養(yǎng),利用CCK-8方法檢測CTLA-4+乳腺腫瘤細胞處理后的DC細胞對T淋巴細胞增殖能力的影響。4.將CTLA-4+乳腺腫瘤細胞處理后的DC細胞與初始CD4+T細胞或CD8+T細胞共培養(yǎng),采用流式細胞術和液相懸浮芯片技術檢測CTLA-4+乳腺腫瘤細胞處理后的DC細胞對初始CD4+T細胞極化、CD8+細胞殺傷能力的影響。5.采用western blotting方法檢測CTLA-4+乳腺腫瘤細胞影響DC細胞成熟的相關信號通路。6.利用CCK-8、流式細胞術等技術檢測CTLA-4功能性抗體對CTLA-4+乳腺腫瘤細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響。結果:1.流式細胞術顯示CTLA-4在乳腺腫瘤細胞中均有表達,且胞內表達高于胞膜表達。2.CTLA-4+乳腺腫瘤細胞抑制了 DC細胞的表型成熟,主要表現(xiàn)在CD83、CD40、CD80、CD86和HLA-DR表達的下調。但在阻斷CTLA-4后,DC細胞的表面標志有不同程度的升高,且細胞因子IL-1β、IL-2、IL-12和TNF-α的分泌水平也顯著提高。3.CTLA-4+乳腺腫瘤細胞處理的DC細胞誘導CD4+/CD8+T細胞增殖的能力明顯減弱。4.CTLA-4+乳腺腫瘤細胞處理的DC細胞抑制CD4+初始T細胞向Th1方向極化,但對Th2的極化無明顯影響,主要表現(xiàn)在CD4+IFN-γ+T細胞比例明顯降低,Th1型細胞因子(IL-1β、IFN-y和TNF-α)的分泌水平改變。5.CTLA-4+乳腺腫瘤細胞處理的DC細胞抑制CD8+T細胞顆粒酶B的產(chǎn)生和細胞因子的分泌。6.CTLA-4+乳腺腫瘤細胞抑制DC細胞成熟和功能是通過異常的激活ERK和STAT3通路來實現(xiàn)。7.CTLA-4功能性抗體可直接抑制CTLA-4+乳腺腫瘤細胞的增殖,促進其凋亡,但對細胞周期無明顯作用。結論:我們的研究首次證實了乳腺腫瘤細胞表面的抑制性分子CTLA-4可以直接作用于腫瘤微環(huán)境中的DC細胞,通過抑制DC細胞的成熟和功能來達到腫瘤的免疫逃逸,而阻斷CTLA-4可以恢復DC細胞活性,并直接抑制乳腺癌細胞的惡性生物學行為。本研究揭示了乳腺腫瘤患者免疫功能低下的根本原因,也為腫瘤免疫學及腫瘤免疫治療的基礎和臨床研究提供了新思路和線索,為后續(xù)的抗腫瘤治療研究提供了新靶點。第二部分在低氧饑餓狀態(tài)下腫瘤源性IL-35通過誘導自噬促進乳腺腫瘤細胞的存活目的:自噬(autophagy)是一種通過調節(jié)細胞內容物降解和再利用來滿足細胞自身代謝需要的過程。這種能量再利用的特殊生存機制在維持細胞自我修復、正常運轉和逃避惡劣環(huán)境(如炎癥、低氧、饑餓等)方面發(fā)揮著至關重要的作用。同時,自噬作為一種新型的細胞死亡機制,與凋亡存在密切聯(lián)系,即在一定程度上細胞可以通過增強自噬來避免凋亡,幫助細胞抵抗惡劣生存環(huán)境。乳腺癌是一個典型的實體性腫瘤,隨著腫瘤細胞的無限制增殖,腫瘤內部存在廣泛的低氧缺血區(qū)域。因此,乳腺癌組織中存在著廣泛的自噬激活現(xiàn)象,顯著增強了其對缺氧營養(yǎng)貧瘠的耐受能力。IL-35是近年來新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制性細胞因子,屬于IL-12細胞因子家族,由EB病毒誘導的基因 3(Epstein-Barr Virus Induced Gene 3,EBI3)和 IL-12α 亞基p35以異二聚體的形式組成。除Treg和Breg外,IL-35也可表達于多種腫瘤細胞,如肺癌、直腸癌、胰腺癌中,且參與腫瘤的發(fā)生演進。我們前期研究及本研究結果發(fā)現(xiàn),IL-35不僅高表達于乳腺癌組織的浸潤淋巴細胞中,也在乳腺腫瘤細胞中廣泛表達,且IL-35可以促進乳腺腫瘤細胞的增殖,對乳腺腫瘤細胞起到一定的保護作用,同時低氧饑餓(hypoxia and serum deprivation,H/SD)狀態(tài)下乳腺腫瘤細胞表面IL-35的受體表達明顯上調。但IL-35是否在低氧饑餓狀態(tài)下對乳腺腫瘤細胞發(fā)揮保護作用?IL-35是否參與低氧饑餓狀態(tài)下乳腺腫瘤細胞的自噬?目前尚無報道。本部分旨在研究低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對乳腺腫瘤細胞自噬水平的影響及其相關信號通路;低氧饑餓狀態(tài)下IL-35介導的乳腺腫瘤細胞自噬改變對細胞增殖和凋亡水平的影響。方法:1.利用免疫組化和免疫熒光染色方法檢測乳腺癌組織和細胞中IL-35的表達,同時利用流式細胞術檢測在正常和低氧饑餓狀態(tài)下乳腺腫瘤細胞表面IL-35受體的表達。2.采用CCK-8、細胞周期檢測、凋亡檢測和western blotting等方法檢測在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對乳腺腫瘤細胞增殖和凋亡的影響。3.采用MDC染色和western blotting方法檢測在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對乳腺腫瘤細胞自噬的影響。4.選用自噬抑制劑3-MA和Baf-AI,通過CCK-8、流式細胞術等方法檢測阻斷自噬后IL-35對乳腺腫瘤細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響。5.利用western blotting方法檢測在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35對乳腺腫瘤細胞自噬相關分子信號通路的影響。結果:1.通過免疫組化和免疫熒光染色顯示乳腺癌組織和細胞均表達IL-35的兩個亞基EB13和1L-12p35,且存在共定位效應。流式細胞術檢測顯示乳腺腫瘤細胞表達IL-35受體,且低氧饑餓狀態(tài)下的IL-35受體表達上調。2.在低氧饑餓狀態(tài)下,IL-35促進乳腺腫瘤細胞的增殖,逆轉低氧饑餓導致的細胞周期G1期阻滯,抑制乳腺腫瘤細胞的凋亡,上調cyclinD1、cyclinE1、CDK2和Bcl-2蛋白的表達,下調p27、Bax和cleaved caspase3蛋白的表達,且呈劑量依賴性。3.IL-35在低氧饑餓狀態(tài)下促進了乳腺腫瘤細胞的自噬。利用自噬抑制劑3-MA和Baf-A1阻斷自噬后,IL-35對乳腺腫瘤細胞的保護作用明顯減弱,表現(xiàn)為細胞增殖受抑制,凋亡比例增加。4.western blotting結果表明,在低氧饑餓狀態(tài)下,IL-35可通過下調乳腺腫瘤細胞中p-mTOR、p-AKT和PI3K的表達促進腫瘤細胞的自噬。結論:在本部分研究中,我們證實了 IL-35可組成性、高水平表達于乳腺癌組織和細胞中,并首次證明,在低氧饑餓狀態(tài)下IL-35可通過抑制mTOR/AKT/PI3K信號通路而誘導乳腺腫瘤細胞自噬,從而促進其增殖、抑制其凋亡。本研究首次報道了這種IL-35促進實性乳腺腫瘤惡性演進的新機制,并為乳腺腫瘤的輔助治療提供了全新的治療靶點。第三部分 IL-35抑制樹突狀細胞的成熟和功能目的:IL-35作為一種重要的抑制性細胞因子,其免疫抑制功能已很明確,不僅能夠直接抑制效應性T淋巴細胞的增殖及其細胞因子的分泌,抑制Th17細胞的極化和細胞因子IL-17的產(chǎn)生,促進Treg的增殖。此外,IL-35還能誘導初始T淋巴細胞轉變成分泌IL-35的Treg(IL-35 induced regulatory T cell,iTr35),從而級聯(lián)放大Treg的免疫調節(jié)作用。腫瘤源性IL-35可通過募集髓系來源抑制性細胞促進腫瘤血管形成,進而發(fā)揮促進腫瘤生長和抑制機體抗腫瘤免疫。我們在前期研究和本研究中發(fā)現(xiàn),IL-35在乳腺腫瘤組織和腫瘤浸潤性淋巴組織中高表達,且其表達的水平與臨床分期和淋巴結轉移密切相關。但是,目前關于IL-35對于腫瘤微環(huán)境中DC細胞的影響尚未報道。本研究利用外源性IL-35替代腫瘤自分泌或旁分泌的IL-35作用于人外周血單核細胞來源DC細胞來模擬腫瘤微環(huán)境中IL-35對DC細胞作用的體外模型,觀察IL-35對DC細胞分化、成熟和免疫學功能的影響,并探討其可能的作用機制。方法:1.通過流式細胞術檢測DC細胞中IL-35及其受體的表達。2.將IL-35分別作用于DC細胞分化或成熟階段,利用流式細胞術和液相懸浮芯片技術檢測IL-35對DC細胞表型和細胞因子分泌的影響。3.建立IL-35處理的DC細胞與CD4+/CD8+T細胞共培養(yǎng)體系,利用CCK-8技術檢測IL-35處理的DC細胞對不同T淋巴細胞亞群增殖能力的影響。4.將IL-35處理的DC細胞與初始CD4+T細胞或CD8+T細胞共培養(yǎng),采用流式細胞術和液相懸浮芯片技術檢測IL-35處理的DC細胞對初始CD4+T細胞極化、CD8+細胞功能的影響。5.利用western blotting方法檢測IL-35影響DC細胞成熟和功能的相關信號通路。結果:I.DC細胞本身不能分泌IL-35且外源性IL-35亦不能誘導DC細胞表達和分泌IL-35,但是CD14+單核細胞和DC細胞均有IL-35受體的表達。2.IL-35部分抑制DC細胞的分化,主要表現(xiàn)在分化標志性表型CD1a和CD209的表達部分下調。3.IL-35顯著抑制DC細胞的表型成熟和細胞因子的分泌,主要表現(xiàn)為HLA-DR、CD40、CD80、CD86、CD83 的表達下調和細胞因子 IL-1β、IL-2、IL-12p70、IFN-y和TNF-α分泌水平降低。4.與正常對照組DC細胞相比,IL-35處理的DC細胞顯著抑制CD4+/CD8+T細胞的增殖,限制初始CD4+T細胞向Th1細胞極化和CD8+T細胞的殺傷能力。5.IL-35主要是通過異常激活STAT1/STAT3和抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路來抑制DC細胞的成熟和功能。結論:在本研究中,我們首次證明,除作用于T細胞和B細胞外,IL-35也可抑制DC細胞的功能,其作用主要表現(xiàn)為抑制DC細胞的成熟,而這種成熟能力受限的DC細胞可進一步抑制T細胞的增殖,并降低初始CD4+T細胞向Th1細胞的極化和CD8+T細胞的殺傷功能,從而進一步降低機體的特異性免疫。IL-35對DC細胞功能的抑制主要是通過異常激活STAT1/STAT3和抑制p38MAPK/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。本課題為腫瘤的免疫逃逸機制研究提供了有力的補充,提示IL-35在腫瘤的發(fā)生演進中發(fā)揮著重要作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

圖１－１：流式細胞術檢測ＣＴＬＡ－４在乳腺腫瘤細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和ＭＣＦ－７）逡逑中的表達情況。（左）顯示乳腺腫瘤細胞胞膜的ＣＴＬＡ－４表達；（右）顯示逡逑乳腺腫瘤細胞胞內的ＣＴＬＡ－４表達，同時選用相應的同型對照做對比。逡逑

邐ＰＬ？－＾邐Ｆｌｌ邋Ｈ逡逑圖１－２：邋ＣＴＬＡ－４＋乳腺腫瘤細胞對ＤＣ細胞成熟表型的影響。將ＣＴＬＡ－４＋逡逑乳腺腫瘤細胞系與人外周血中．核細胞來源Ｄ邋Ｃ細胞按１邋：１的比例共培YM４邋８邋ｈ

本文編號：2719632