【摘要】：Hippo信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條在器官大小發(fā)育和癌癥發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要功能的信號(hào)通路。Hippo信號(hào)通路的核心部分是由MST1/2和LATS1/2構(gòu)成的激酶鏈。MST1/2激酶結(jié)合支架蛋白SAV1,磷酸化LATS1/2和MOB1A/B,促進(jìn)LATS1/2和MOB1A/B之間的相互作用并激活LATS1/2的激酶活性。LATS1/2繼而磷酸化Hippo通路下游的轉(zhuǎn)錄輔激活因子YAP及其同源蛋白TAZ。磷酸化的YAP/TAZ通過(guò)結(jié)合支架蛋白14-3-3被滯留在細(xì)胞質(zhì)中,或通過(guò)泛素化途徑被降解。當(dāng)Hippo信號(hào)通路失活時(shí),YAP/TAZ去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞增殖和干性、抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因表達(dá)。在小鼠肝臟中特異性敲除Nf2、Sav1、Mst1/2或轉(zhuǎn)基因表達(dá)Yap能迅速導(dǎo)致肝臟變大并進(jìn)而導(dǎo)致肝癌發(fā)生。進(jìn)一步研究表明YAP的激活不但通過(guò)細(xì)胞自主性的方式促進(jìn)腫瘤,還能夠通過(guò)招募巨噬細(xì)胞來(lái)對(duì)抗免疫監(jiān)視,使腫瘤起始細(xì)胞能夠免于被清除。對(duì)人腫瘤樣品的研究也發(fā)現(xiàn)Hippo通路的變異對(duì)許多癌癥的發(fā)生發(fā)展起到了關(guān)鍵的作用。例如NF2突變是二型神經(jīng)纖維瘤最主要的抑癌基因突變;GNAQ/11突變?cè)?0%以上的葡萄膜黑色素瘤中發(fā)生;YAP的基因擴(kuò)增在肝癌等多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)YAP的激活不但促進(jìn)腫瘤發(fā)生,還與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等密切相關(guān)。因此學(xué)術(shù)界和生物醫(yī)藥界都對(duì)開發(fā)YAP的抑制劑作為抗癌藥物的思路表現(xiàn)出了很大的興趣。目前,靶向YAP活性的抑制劑研究雖然已經(jīng)有了一些進(jìn)展,但發(fā)現(xiàn)具有更高活性、更小毒性和更高成藥性的抑制劑仍然任重道遠(yuǎn)。為了尋找YAP的小分子抑制劑,我們建立了基于報(bào)告基因的YAP活性檢測(cè)體系,并對(duì)國(guó)家新藥篩選中心的五萬(wàn)多種化合物進(jìn)行了篩選。我們發(fā)現(xiàn)來(lái)自茜草科植物的天然環(huán)肽化合物RA-V抑制了 YAP和TAZ的報(bào)告基因活性。意外的是后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)RA-V并不抑制內(nèi)源YAP靶基因,例如CTGF和CYR61的mRNA水平,但是強(qiáng)烈抑制它們編碼的蛋白的水平。這可能與以前在RA-V的類似物上被報(bào)道過(guò)的通過(guò)抑制EF1和EF2與核糖體的結(jié)合進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)翻譯的活性有關(guān)。由于YAP靶基因編碼的蛋白是Hippo信號(hào)通路生物學(xué)功能的最終執(zhí)行者,我進(jìn)一步研究了 RA-V是否可以抑制YAP導(dǎo)致的器官變大和腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),在肝臟特異性Mst1/2雙敲除小鼠模型中,RA-V顯著抑制了肝臟的異常增大和腫瘤發(fā)生。另外,在YAP過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中,RA-V不但抑制腫瘤發(fā)生,還能有效縮小已經(jīng)形成的腫瘤。機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)RA-V不僅抑制肝腫瘤細(xì)胞的增殖和去分化,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,還能抑制微環(huán)境中免疫細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡。而這些免疫細(xì)胞也是YAP誘導(dǎo)腫瘤起始所必須的。因此,RA-V通過(guò)直接抑制腫瘤細(xì)胞和改造免疫微環(huán)境抑制肝腫瘤。以上研究為RA-V用于治療YAP/TAZ激活的腫瘤奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7
【圖文】：

質(zhì)粒ＰＱＣＸＩＨ－Ｍｙｃ－ＹＡＰ和ＣＴＧＦ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒逡逑ｐＧＬ４．２１－ＣＴＧＦ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ組成，表徸的ＹＡＰ通過(guò)內(nèi)源ＴＥＡＤ結(jié)合到ＣＴＧＦ啟動(dòng)子逡逑上，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因的表達(dá)（圖３．１Ａ）。為了降低背景信號(hào)，我們使用了僅逡逑包含２５０個(gè)堿基的ＣＴＧＦ啟動(dòng)子，該片段已經(jīng)包含所有的三個(gè)ＴＥＡＤ結(jié)合位點(diǎn)。逡逑為了構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，我們首先用表達(dá)潮霉素抗性的ｐＱＣＸＩＨ－Ｍｙｃ－ＹＡＰ質(zhì)粒包裝逡逑逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞。在潮霉素篩選后對(duì)仍然存活的細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)嘌呤逡逑霉素抗性的ｐＧＬ４．２１－ＣＴＧＦ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ質(zhì)粒，然后用嘌呤霉素去篩選并挑單克隆擴(kuò)逡逑增后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。最終在多個(gè)單克隆中，我們選擇了報(bào)告基因活性更逡逑高的單克�。矗模保板澹▓D３．１Ｂ）。為了驗(yàn)證該報(bào)告基因體系的靈敏度，我們分別檢測(cè)逡逑了敲低ＹＡＰ表達(dá)和已知ＹＡＰ抑制劑處理?xiàng)l件下報(bào)告基因體系活性的變化。結(jié)果顯逡逑示用ｓｈＲＮＡ敲低ＹＡＰ的表達(dá)水平（圖３．１Ｃ），或使用干擾ＹＡＰ與ＴＥＡＤ結(jié)合的逡逑化合物Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｍ邋（ＶＰ）處理（圖３．１Ｄ）均顯著抑制報(bào)告基因活性，說(shuō)明該報(bào)告逡逑基因體系可以準(zhǔn)確反映ＹＡＰ活性。因此該細(xì)胞克隆可被用于后續(xù)篩選。逡逑５８逡逑

光素酶活性的抑制率大于６０％，細(xì)胞活力大于８０％的篩選標(biāo)準(zhǔn)，挑選出５６個(gè)細(xì)胞逡逑毒性相對(duì)較低且抑制效果相對(duì)明顯的陽(yáng)性化合物。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，我們將這逡逑些化合物依次編號(hào)為１？５６邋（圖３．２Ｂ）。逡逑Ａ邋＾邐逡逑？２＊＆邋２＆４ｊ邋Ｉ逡逑２３Ｔ邋２＜ＪＪ邋ｉ逡逑■２２６邋？Ｗ｜邋｜邐Ｂ逡逑＇邋■逡逑２０＊邋Ｋ）９｜邋Ｉ逡逑？邋１０３，９６１邋ＳＬ邐１６０邋Ｉ￣￣；—￣ｉ邐逡逑＇—－１８１邋１６Ｔ］邋■■逡逑＾邐１７０邋１Ｔ６１邋￡邐匕邋１４０邋１邋火逡逑．＞邋，ｕｓ邋ｉｓ５｜邋ｍｍ邐＿＞＾邐＇？邐２邋＊逡逑＾邐＾＊＞３１邐？0邋１２０邋、：？？備邋＊拿’邐？逡逑Ｈｉ逡逑？邋以丨邋ａｓｓｓｓｓｒ－邐２0逡逑０邋１－＾邐邐－Ｊ逡逑邐邐＿邐０邐５０邐１００邋１５０邋２００邋２５０邋３００逡逑２：邋？邐，邐邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｌｕｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）逡逑８邐０邐Ｏ邐Ｏ邐Ｏ邐Ｋ３逡逑＾邐°邐°邐８邐Ｓ邐Ｓ逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｗｅｌｌｓ逡逑圖３．２使用ＹＡＰ／ＣＴＧＦ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ報(bào)告基因體系對(duì)化合物進(jìn)行高通量初篩及初篩陽(yáng)逡逑性化合物驗(yàn)證。Ａ，高通量初篩實(shí)驗(yàn)中各相對(duì)熒光素酶活性區(qū)段的孔的數(shù)量分布。逡逑每個(gè)區(qū)段的寬度為５．６％，星號(hào)標(biāo)注的區(qū)域相對(duì)熒光素酶活性小于３０％。Ｂ，初篩逡逑結(jié)果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中

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本文編號(hào)：2719573