【摘要】：目的:探討慢病毒介導的線粒體核糖體蛋白大亞基35(MRPL35)表達下調(diào)對大腸癌細胞HCT116功能的影響,并初步分析其分子機制。方法:1.慢病毒感染大腸癌細胞HCT116慢病毒shRNA-MRPL35及shRNA-Control分別感染大腸癌細胞HCT116,然后收集細胞沉淀提取RNA和蛋白質(zhì),通過熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測MRPL35在mRNA和蛋白水平的敲低效率。2.檢測低表達MRPL35對HCT116細胞功能的影響通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,同時使用Western blot技術(shù)檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9,Bax,Cleaved-PARP等的表達情況。再通過MTT、基質(zhì)膠侵襲實驗和劃痕實驗檢測低表達MRPL35對HCT116細胞增殖和侵襲遷移能力的影響。3.低表達MRPL35影響HCT116細胞凋亡的分子機制研究通過熒光染色及流式細胞術(shù)觀察并檢測線粒體活性氧(ROS)和線粒體膜電位的改變,運用Western blot技術(shù)檢測JNK、ATM及凋亡相關(guān)蛋白P53的表達變化。然后使用GV147/MRPL35~(+/+)質(zhì)粒及GV147空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述低表達MRPL35的細胞株,檢測P53等凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。結(jié)果:1.獲得MRPL35基因低表達大腸癌細胞株HCT116,敲減組較對照組mRNA下調(diào)了0.57倍,且蛋白表達水平也明顯下調(diào)。2.低表達MRPL35后,大腸癌細胞凋亡率增加、增殖減少,而其侵襲和遷移能力沒有發(fā)生改變。3.低表達MRPL35后,線粒體ROS含量增加,線粒體膜電位降低,JNK及ATM均被激活,凋亡相關(guān)蛋白P53磷酸化水平表達上調(diào)。過表達MRPL35后,P53磷酸化水平下調(diào)。結(jié)論:MRPL35基因表達下調(diào)可以增加線粒體ROS,降低線粒體膜電位。過量的ROS使JNK磷酸化激活,并引發(fā)DNA損傷使ATM磷酸化激活,從而共同激活P53依賴的線粒體凋亡通路,促進大腸癌細胞凋亡。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34
【圖文】：

圖 1 慢病毒 shRNA-MRPL35 感染 HCT116 細胞熒光圖A：光鏡下檢測；B：同一視野熒光鏡下檢測Fig 1 Fluorescence photos of HCT116 cells after infection of shRNA-MRPL35A: Light microscope detection; B: The same area under the excitation of fluorescence

圖 3 低表達 MRPL35 抑制大腸癌細胞 HCT116 增殖Fig 3 Downregulation of MRPL35 inhibited HCT116 proliferation

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2713054