【摘要】：研究背景惡性胸膜間皮瘤(Malignant pleural mesothelioma,MPM)是一種起源于胸膜間皮細胞的高侵襲性腫瘤,與石棉暴露密切相關(guān)。MPM曾被認為是一種非常罕見的疾病,但在過去幾十年中,MPM的發(fā)病率有逐年增加的趨勢。有流行病學預測表明:惡性胸膜間皮瘤的發(fā)病率將在未來10年繼續(xù)增加并達到高峰。每年全世界約有43000人死亡,預期到2020年死亡率也不會下降。從石棉暴露到發(fā)病,大概有30-40年的潛伏期。由于MPM缺乏典型癥狀、體征和影像學表現(xiàn),單純臨床診斷仍舊比較困難。盡管手術(shù)聯(lián)合放化療、靶向治療等綜合治療能提高間皮瘤患者的生存率和生活質(zhì)量,但整體治療效果不佳。由于MPM惡性程度高、侵襲性強、預后差,大多數(shù)患者生存率仍不足12-18個月,長期生存狀況令人擔憂。因此,MPM在較長時間內(nèi)仍將是一個主要的公眾健康難題,尋找新的、有效的藥物仍為目前MPM防治的關(guān)鍵。MPM的發(fā)病機制復雜,涉及多種信號通路及分子的異常調(diào)控。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal-epithelial transition factor,MET)是由原癌基因MET編碼的蛋白產(chǎn)物,是一類具有自主磷酸化活性的跨膜受體,屬于酪氨酸激酶受體(Receptor tyrosine kinases,RTKs)超家族成員。酪氨酸激酶受體在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。HGF是一種多肽生長因子,它誘導上皮細胞遷移、侵襲,參與免疫活性、組織再生及血管生成的調(diào)節(jié)。HGF與MET受體特異性結(jié)合后使MET的酪氨酸殘基磷酸化,激活MET受體胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶,進而啟動下游信號通路,從而促進腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管新生、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程。有研究表明,HGF通過激活PI3K/ERK5/Fra-1傳導通路誘導惡性間皮瘤細胞增殖,而且HGF能促進間皮瘤細胞的磷酸化。阻斷HGF/MET信號通路可有效抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 5(extracellular regulated kinase5,ERK5)是 MAPK系統(tǒng)中的一個重要的一級激酶,ERK5信號轉(zhuǎn)導通路也是MAPK信號轉(zhuǎn)導通路中重要組成部分。通過ERK5信號通路的磷酸化級聯(lián)反應,多種刺激因素激活MEKK3或MEKK2,再激活MEK5,最后激活ERK5,進而調(diào)節(jié)特定基因的表達。MEK5是ERK5唯一且特異性上游激酶,它對于ERK5激酶具有高度特異性,即使在MEK5過表達的情況下也不激活MAPK家族的其他成員。ERK5不僅可以促進細胞生存及抑制細胞凋亡等過程,而且與細胞的血管發(fā)育、增殖等功能密切相關(guān)。Ramos等研究發(fā)現(xiàn)惡性間皮瘤與ERK5信號通路有關(guān)。Doublecortin-like kinase 1(DCLK1)是一種跨膜微管相關(guān)蛋白激酶,編碼的蛋白質(zhì)具有DCX結(jié)構(gòu)域和C末端的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。DCLK1被認為是一種新的胃腸道正常干細胞的標記物。抑制DCLK1的表達,就可抑制腫瘤組織生長。在腫瘤組織中,有多種轉(zhuǎn)錄因子、激酶、miRNA等參與了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。DCLK1陽性細胞具有更強的EMT,使腫瘤細胞具有更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。盡管DCLK1在許多腫瘤細胞中都有表達,但是目前關(guān)于DCLK1在惡性間皮瘤中的表達及其預后關(guān)系的研究卻比較少,而且MET、ERK5和DCLK1之間的關(guān)系尚不明確。因此,本研究旨在探討MET、ERK5和DCLK1是否可作為診斷惡性胸膜間皮瘤生物標記物的可能性,為MPM的免疫治療提供新的靶向位點。研究目的:1.研究MET、ERK5和DCLK1在MPM細胞中的表達水平,闡明MET、ERK5和DCLK1作為診斷MPM生物標記物的可能。2.研究DCLK1的表達與MPM患者生存期的關(guān)系,闡明DCLK1可能是評價MPM患者預后的一個因素。3.通過細胞活性實驗觀察MET和ERK5抑制劑對MPM細胞增殖活性的影響。4.通過Western blot技術(shù)和RT-PCR技術(shù),觀察MET抑制劑或ERK5抑制劑在轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯水平對MET/ERK5/DCLK1通路調(diào)控的影響。5.研究MET抑制劑和ERK5的抑制劑與MPM的侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系,為有效防治MPM提供藥物治療新靶點。研究方法:1.惡性間皮瘤組織及癌旁組織取自1997.7-2008.12加州大學舊金山醫(yī)學中心結(jié)果確診為MPM患者的標本。所取臨床標本經(jīng)加州大學舊金山醫(yī)學中心倫理委員會審計批準。2.免疫組化方法:對73例組織標本的組織微陣列切片及間皮細胞瘤細胞系H290、H513、H28、211H、MS-1、H2052和正常間皮細胞系LP9行免疫組化染色,明確MPM組織標本及細胞中MET、ERK5和DCLK1的表達情況。3.Celltiter-GloTM方法檢測細胞增殖活性:細胞接種于96孔板培養(yǎng),配制不同的XL184和XMD8-92藥物終濃度后再細胞培養(yǎng)48h。加入CellTiter-GloTM試劑,檢測板用GloMax-96微孔板多功能光度計進行讀數(shù),利用GraphPad Prism 6軟件,計算IC50值,并繪制劑量-反應曲線。4.細胞遷移侵襲實驗:經(jīng)稀釋的300 μ 1 Matrigel基質(zhì)包被于6孔板小室中,收集藥物處理后的細胞,無血清培養(yǎng)基制成細胞懸浮液,下室加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基2.6ml,培養(yǎng)20h,取出小室,置于4g/L結(jié)晶紫的小孔內(nèi)室溫染色20min后顯微鏡下計數(shù)、照相。5.腫瘤細胞成球?qū)嶒?收集藥物處理后的單細胞懸液,將1× 103數(shù)量的細胞鋪入24孔超低粘附培養(yǎng)板,加入無血清培養(yǎng)液,1周孵育后,10×倒置顯微鏡下計數(shù)腫瘤數(shù)目(直徑超過60μm的腫瘤細胞)。6.Quantitative Real-time RT-PCR(qRT-PCR):使用 Rneasy Mini kit 試劑盒提取處理后細胞的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA后,再進行實時定量PCR反應,檢測目的基因mRNA表達水平的改變。7.Western blot:使用細胞裂解液裂解處理后細胞,測定蛋白濃度,使其高溫變性,再使用SDS-PAGE膠進行凝膠電泳,最后應用免疫印跡檢測目的蛋白的表達水平。8.統(tǒng)計學分析:符合正態(tài)分布的數(shù)值變量資料以均數(shù)±標準差(x ±s)表示;兩組之間的比較使用t test;多組之間的比較使用單因素ANOVA Scheffe法;比較MET、ERK5和DCLK1在同一惡性間皮瘤細胞中IHC染色強度使用Chi-square檢驗;其他的數(shù)據(jù)分析使用 GraphPad Prism(Version 6.0;GraphPad Sof tware,San Di ego,CA,USA);總生存曲線繪制采用 GraphPad Pri sm 中的Kaplan-Meier分析。所有統(tǒng)計學數(shù)據(jù)P0.05被認為具有統(tǒng)計學差異。研究結(jié)果:1.MET、ERK5和DCLK1在MPM組織標本及細胞中過度表達(1)對73例組織標本的組織微陣列切片及間皮細胞瘤細胞系H290、H513、H28、211H、MS-1、H2052和正常間皮細胞系LP9行MET、ERK5和DCLK1的免疫組化染色。分析數(shù)據(jù)表明,在間皮瘤組織中,MET、ERK5和DCLK1三種蛋白均中度陽性和強陽性表達的為38.4%(n=28)。MET、ERK5和DCLK1之間的相關(guān)性分析表明統(tǒng)計學有顯著差異(P0.05)。(2)在組織標本中對MET、ERK5和DCLK1行免疫組化評分,統(tǒng)計學分析表明,三者在間皮瘤組織標本的表達水平明顯高于正常胸膜間皮組織標本(P0.05)。2.DCLK1高度表達提示MPM預后不良(1)DCLK1在惡性間皮瘤組織中的表達水平明顯高于正常胸膜間皮組織,有明顯的顯著性差異(P=0.000409),表明DCLK1可能對惡性間皮瘤的發(fā)生有致瘤作用。(2)DCLK1在MPM腫瘤組織中的表達與患者臨床病理資料的相關(guān)性分析:數(shù)據(jù)表明,DCLK1與患者的年齡、性別、吸煙狀態(tài)和TNM分期之間均沒有顯著性差異(P0.05)(3)DCLK1表達和MPM患者總生存期(OS)之間的相關(guān)性分析DCLK1高表達者比低表達者總生存期明顯縮短(P=0.0235),表明DCLK1的表達水平可能是影響MPM患者生存期的一個因素。3.MRT和ERK5的抑制劑能夠抑制間皮瘤細胞的細胞增殖活性采用Celltiter-GloTM方法檢測細胞增殖活性,在劑量-反應曲線上可檢測到各細胞株的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和細胞活性。IC50表明XL184和XMD8-92對不同的細胞系,有不同程度的抑制作用,其藥物濃度越高,MPM細胞的活性就越低。XL184和XMD8-92分別對MET、ERK5高表達的MPM細胞靈敏度較高。4.MET或ERK5抑制劑可引起MET/ERK5/DCLK1通路DCLK1的下調(diào)(1)采用Wesestern blot技術(shù),間皮瘤細胞經(jīng)XL184或XMD8-92處理后,檢測發(fā)現(xiàn)磷酸化MET、磷酸化ERK5和DCLK1的蛋白水平下降。(2)采用RT-PCR技術(shù),間皮瘤細胞經(jīng)XL184或XMD8-92處理后,檢測發(fā)現(xiàn)DCLK1的mRNA水平明顯降低,這些結(jié)果表明MET或ERK5的抑制劑能夠降低MPM細胞磷酸化ERK5和DCLK1的表達。進一步說明了 DCLK1位于MET/ERK5信號通路的下游。5.MET或ERK5的抑制劑不僅能抑制H290細胞的遷移、侵襲,并且抑制H290細胞的腫瘤細胞成球能力(1)采用Transwell細胞遷移、侵襲實驗觀察MET和ERK5的抑制劑處理H290細胞,20小時后發(fā)現(xiàn)處理組H290細胞穿透小孔的能力均較空白對照組DMSO明顯下降表明MET或ERK5的抑制劑能抑制H290細胞的遷移和侵襲。(2)采用腫瘤成球?qū)嶒炓杂^察MET和ERK5抑制劑對MPM腫瘤干細胞的自我更新能力的影響,表明H290細胞的球體形成的效率隨藥物的濃度的上升而下降,呈現(xiàn)出濃度依賴性。結(jié)論:1.本實驗發(fā)現(xiàn)MET、ERK5和DCLK1在MPM腫瘤組織及細胞中高表達,且MET、ERK5和DCLK1在間皮瘤組織標本的表達水平明顯高于正常胸膜間皮組織標本。2.在MPM患者中,DCLK1高表達者比低表達者生存期明顯縮短,DCLK1有可能成為預測惡性胸膜間皮瘤預后的一個因子。3.研究DCLK1在MET和ERK5表達調(diào)控中的作用,闡明了 DCLK1位于MET和ERK5的下游水平。4.探討MET/ERK5/DCLK1信號傳導通路的活性可能在MPM細胞的生長過程中發(fā)揮重要作用。MET、ERK5和DCLK1可能作為惡性胸膜間皮瘤診斷標記物,為MPM的免疫治療提供新的靶向位點,并且闡明小分子抑制劑可能為惡性胸膜間皮瘤提供新的治療手段。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.3
【圖文】：

圖１邋ＭＥＴ在人正常間皮組織與惡性間皮瘤組織標本中的ＩＨＣ染色結(jié)果逡逑（Ａ）邋ａ和ｂ正常間皮組織標本；ｃ－ｈ惡性間皮瘤組織標本：ｃ和ｄ染色陰性，ｅ逡逑和ｆ中度陽性染色，ｇ和ｈ強陽性染色。（Ｂ）間皮瘤細胞系：ａ和ｂ－－Ｈ２９０細胞逡逑強陽性染色；ｃ和ｄ—Ｈ５１ｌ強陽性染色；ｅ和ｆ—邋Ｈ２８細胞強陽性染色；ｇ和ｈ邋—２１１Ｈ逡逑強陽性染色；ｉ和ｊ—ＭＳ－１細胞染色陰性；ｋ和一Ｈ２０５２細胞陰性染色；ｍ和ｎ—ＬＰ９逡逑正常間皮細胞染色陰性。逡逑４３逡逑

圖２邋ＥＲＫ５在人正常間皮組織與惡性間皮瘤組織標本中的ＩＨＣ染色結(jié)果逡逑（Ａ）邋ａ和ｂ正常間皮組織標本；ｃ－ｈ惡性間皮瘤組織標本：ｃ和ｄ染色陰性，ｅ逡逑和ｆ中度陽性染色，ｇ和ｈ強陽性染色。（Ｂ）間皮瘤細胞系：ａ和ｂ—Ｈ２９０細胞逡逑強陽性染色；ｃ和ｄ邋—Ｈ５１３強陽性染色；ｅ和ｆ－邋Ｈ２８細胞中度陽性染色；ｇ和逡逑ｈ－－２１１Ｈ染色陰性；ｉ和ｊ－－邋ＭＳ－１細胞染色陰性；ｋ和１—Ｈ２０５２細胞陰性染色；逡逑ｍ和ｎ＿－ＬＰ９正常間皮細胞染色陰性。逡逑４４逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2713306