發(fā)布時間：2020-06-14 14:27

【摘要】：第一部分 miR-494在非小細(xì)胞肺癌中的功能與機(jī)理研究肺癌是世界上最常見的腫瘤之一,具有很高的死亡率,隨著近年來空氣污染加重,肺部疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響人類健康和生活水平。由于目前癌癥診斷技術(shù)發(fā)展的限制,肺癌確診時期已經(jīng)是中晚期,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)肺癌5年生存率不到15%。肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌兩種類型,其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占整個肺癌的80%以上,包括鱗癌和腺癌兩種類型。做為常見的一種惡性腫瘤,雖然臨床越來越多的科學(xué)研究者針對其診斷、治療及預(yù)后等進(jìn)行研究,但關(guān)于其早期診斷的精確性以及費用,有效精準(zhǔn)治療方向仍然需要進(jìn)一步的研究與探索,因此目前非小細(xì)胞肺癌的新型診斷及機(jī)制研究顯得尤為重要。miR-494能夠在包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種癌癥中起到重要作用。盡管目前關(guān)于miR-494的研究已經(jīng)初步揭示其功能,但是關(guān)于其作用機(jī)制仍然了解較少。在本次研究中,通過實時定量PCR發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者血清中miR-494含量明顯高于正常人,在包括miR-125a、miR-125b、miR-101-3p在內(nèi)的與非小細(xì)胞肺癌聯(lián)系緊密的四種microRNA中,miR-494在癌癥患者與正常人血清中差異最大,miR-125b無顯著差異。我們選擇差異最大的miR-494作為肺癌機(jī)制研究的對象,用Fisher精確檢測分析miR-494含量與臨床病例特征,其中發(fā)現(xiàn)其與臨床病理分期(P=0.005)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)均有明顯的相關(guān)性。miR-494在非小細(xì)胞肺癌III-IV血清中含量明顯高于I-II,以正常血清為對照,ROC曲線分析分別顯示了其可能作為癌癥分期診斷標(biāo)志物的高靈敏性和特異性。細(xì)胞內(nèi)用CCK-8實驗、克隆形成實驗及流式測其凋亡實驗研究過表達(dá)miR-494之后的表型變化發(fā)現(xiàn),miR-494能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成并降低順鉑的致死性。雙熒光素酶標(biāo)記實驗證實miR-494能夠靶向作用于CASP2并抑制其表達(dá)水平,不僅如此,siRNA敲低CASP2的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、降低順鉑的毒性及促進(jìn)A549細(xì)胞的平板克隆形成。用過表達(dá)CASP2的回復(fù)實驗驗證,相對比過表達(dá)miR-494或者miR-494/pLVX-puro,過表達(dá) miR-494/pLVX-CASP2 之后能夠明顯減緩 miR-494 的促增殖、促克隆形成作用,并且提高順鉑在細(xì)胞內(nèi)的毒性。除此之外,western blot檢測下游凋亡蛋白水解酶caspase-3和caspase-7裂解,流式細(xì)胞儀檢測不同表達(dá)組合中A549細(xì)胞凋亡比例均能發(fā)現(xiàn),caspase-2能夠減緩miR-494對順鉑毒性的抑制作用。綜合上述實驗,我們對miR-494和CASP2在非小細(xì)胞肺癌中的功能進(jìn)行了研究,首次發(fā)現(xiàn)miR-494能夠通過調(diào)控CASP2的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、平板克隆形成以及細(xì)胞對順鉑的靈敏性,在肺癌研究進(jìn)展中存在著重要的意義。體外研究發(fā)現(xiàn)miR-494與非小細(xì)胞肺癌活性方面提供了新的功能和機(jī)制。這對于以后miRNA在某種癌癥的表達(dá)量也許可作為某些特定耐藥性的標(biāo)志物或者治療靶標(biāo)提供了很有意義的素材。另外在A549細(xì)胞中中過表達(dá)miR-494做lncRNA芯片雜交,分析miR-494對非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞系中生物學(xué)過程的影響,KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn),miR-494能夠參與腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、NF-κB信號通路、凋亡信號通路的調(diào)節(jié),為miR-494的研究提供了新的思路和方向。第二部分 遺傳型與非遺傳型胃癌轉(zhuǎn)錄組分析在中國,胃癌引起的死亡占整個癌癥死亡中的很大一部分比例。每年有70萬人確診胃癌,幾乎占全球胃癌患者的一半,其中有小部分比例為遺傳彌漫型胃癌。目前國際遺傳型胃癌指定診斷標(biāo)準(zhǔn)為:(1)一代或二代親屬中有兩個或兩個以上的彌漫型胃癌病例,其中有一個人年齡小于50歲,或者(2)一代或二代親屬中有至少3個彌漫型胃癌患者,與年齡無關(guān),或者(3)一個被診斷為彌漫型胃癌的患者,年齡小于40歲,或者(4)個體或者家族被診斷為彌漫型胃癌和小葉乳腺癌,其中1個年齡小于50歲。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,高通量基因表達(dá)檢測的方法得到快速的應(yīng)用,以RNA芯片雜交和二代測序為基礎(chǔ)的檢測為生物分子方向研宄提供了簡潔有效的方法。為了探究胃癌遺傳型在RNA水平的影響,我們選取遺傳彌漫型胃癌組織做轉(zhuǎn)錄組分析,同時以非遺傳型胃癌組織為參考,分析其中的差異。我們通過miRNA-seq研宄組織中miRNA的變化及其預(yù)測靶基因的生物學(xué)特點。GO分析兩者miRNA靶基因在生物學(xué)過程、細(xì)胞組成成分及分子功能差異發(fā)現(xiàn),兩者未出現(xiàn)差異。對靶基因KEGG信號通路分析,遺傳型胃癌miRNA靶基因更多的參與到神經(jīng)調(diào)節(jié)的信號通路,非遺傳腸型胃癌則參與到蛋白消化吸收及粘著連接等信號通路。我們用IncRNA芯片分析mRNA和IncRNA的差異變化,GO的生物學(xué)過程分析兩者均集中在細(xì)胞分裂相關(guān)的生物過程,細(xì)胞成分和分子功能方向無大的差異。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)遺傳型胃癌多參與到細(xì)胞周期、MAPK信號通路,非遺傳腸型胃癌除細(xì)胞周期之外,明顯差異富集在酒精中毒相關(guān)信號通路。通過遺傳型胃癌與非遺傳型胃癌RNA水平對比分析發(fā)現(xiàn),其生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組成均未受到影響,參與信號通路的不同引起了種類及個體差異,為遺傳型胃癌的研究提供了一個重要的研究方向。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2;R735.2
【圖文】：

北兌辦和㈨學(xué)院屮丨如關(guān)學(xué)科Ｔ院抑丨：￥位論文邐第－？部對ｍｉＲ－４９４－３ｐ與肺癌聯(lián)系機(jī)制進(jìn)行探討。逡逑ｃａｓｐａｓｅ全稱是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵參與多種類型的細(xì)胞生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。其家族成員較多，目前人類己發(fā)現(xiàn)逡逑

院１ＭＨ｜阪學(xué)科￥院博」々位論文邐的缺失能夠使特定轉(zhuǎn)基因小鼠逐漸發(fā)展成Ｂ細(xì)胞淋巴瘤（Ｈｏ邋ｅｔ邋ａｌ”ａｌ．，２０１２），在共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ＡＴＭ）缺失小鼠中發(fā)展ｕｃｃｉｎｉ邋ｅｔ邋ａｌ，，２０１３ｂ）。ｃａｓｐａｓｅ－２的缺失還能加快ＮＭＴＶ／ｃ－ｎｅｕ引起的ｔ邋ａｌ．，邋２０１３）和二乙基亞硝胺介導(dǎo)的肝癌（Ｓｈａｌｉｎｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１６）的發(fā)展速Ａｎｄｏ等研究者針對ＤＮＡ損傷試劑和微管抑制劑激活ｃａｓｐａｓｅ－２機(jī)ｃａｓｐａｓｅ－２可能有兩種激活模式，一種依賴于基因毒性的藥物作用，其他多種刺激的激活途徑（Ａｎｄｏ邋ａｎｄ邋Ｐａｒｓｏｎｓ，邋２０１７）。逡逑ＮＨ、、NB１逡逑

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本文編號：2712917