【摘要】：目的:胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC)是一種高致死率的惡性腫瘤,近年來發(fā)病率和死亡率有上升的趨勢。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類短鏈、非編碼RNA,在多種真核細(xì)胞中于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。MicroRNA-506(miR-506)是存在于X染色體上的一種MicroRNA,通過對靶基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控影響細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生命過程。關(guān)于miR-506在胰腺組織和PDAC中的表達(dá)及意義的文獻(xiàn)較少,且相關(guān)文獻(xiàn)均將胰腺導(dǎo)管、腺泡和胰島組織作為一個整體與PDAC進(jìn)行比較。由于大部分PDAC起源于導(dǎo)管上皮,比較miR-506在PDAC細(xì)胞和正常胰腺導(dǎo)管上皮中的表達(dá)水平以評估m(xù)iR-506在PDAC中所起的作用將更為準(zhǔn)確。因此,本研究擬通過兩種方法檢測石蠟包埋PDAC組織中miR-506的表達(dá),并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,提示miR-506在PDAC發(fā)展中的作用;另外,分別檢測miR-506在胰腺導(dǎo)管、胰腺腺泡/胰島中的表達(dá)水平,通過比較正常胰腺組織各成分之間及其與PDAC之間的差異,提示miR-506在PDAC發(fā)生中的表達(dá)變化。方法:1、利用組織芯片(tissue microarray,TMA)和miRNA原位雜交(In Situ Hybridization,ISH)技術(shù),結(jié)合形態(tài)學(xué),檢測miR-506在PDAC、正常胰腺導(dǎo)管以及腺泡/胰島中的表達(dá)水平,并在PDAC中分析miR-506表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。2、利用激光捕獲顯微切割技術(shù)(Laser Capture Microdissection,LCM)和手工切割的方法,從石蠟包埋組織中分離正常的胰腺導(dǎo)管、腺泡/胰島和PDAC,分別提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR),檢測miR-506的表達(dá)情況,并分析PDAC中miR-506表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。3、比較miRNA ISH與qRT-PCR檢測結(jié)果,明確miR-506在胰腺正常組織及PDAC中的表達(dá)特點,并分析兩種方法在檢測石蠟包埋組織中miRNA表達(dá)水平的優(yōu)缺點。結(jié)果:1、在110例PDAC中完成了TMA基礎(chǔ)上的miR-506 ISH,結(jié)果顯示,miR-506在72例(65.5%)和38例(34.5%)PDAC中分別呈高表達(dá)和低表達(dá)。并且,在T3和T4期、低分化和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PDAC中miR-506的表達(dá)水平分別明顯低于T2期(P=0.004)、高-中分化(P=0.023)和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.033)的PDAC,而年齡(P=0.139)、性別(P=0.127)、腫瘤原發(fā)部位(P=0.213)、腫瘤大小(P=0.638)、血管侵犯(P=0.595)及臨床分期(P=0.063)與miR-506的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。在100例PDAC石蠟包埋組織中完成了miR-506的qRT-PCR檢測。對100例PDAC臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示腫瘤直徑4cm、T3和T4期的PDAC中miR-506的表達(dá)水平分別明顯低于腫瘤直徑≤4cm(P=0.04)、T2期(P=0.023)的PDAC,而年齡(P=0.229)、性別(P=0.417)、部位(P=0.21)、分化程度(P=0.305)、血管侵犯(P=0.295)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.401)以及臨床分期(P=0.389)與miR-506的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。2、對TMA上的87例正常胰腺組織進(jìn)行了miR-506 ISH檢測,結(jié)果顯示,miR-506在9.6%(7/73)和90.4%(66/73)的正常胰腺導(dǎo)管上皮中呈高表達(dá)和低表達(dá),在68.3%(45/66)和32.7%(21/66)的正常胰腺組織的腺泡/胰島中呈高表達(dá)和低表達(dá);與第一部分在PDAC中的檢測結(jié)果相比,miR-506在PDAC中的表達(dá)水平高于胰腺的正常導(dǎo)管(P0.001),但低于正常的胰腺腺泡/胰島(P0.001)。對100例PDAC和17例正常胰腺組織的腺泡/胰島和導(dǎo)管進(jìn)行LCM和手工切割,qRT-PCR結(jié)果顯示,在8%(8/100)和92%(92/100)的PDAC中miR-506的表達(dá)分別高于和低于正常胰腺導(dǎo)管上皮,在6%(6/100)和94%(94/100)的PDAC中miR-506的表達(dá)分別高于和低于正常胰腺組織的腺泡/胰島。對10例配對的PDAC及其正常胰腺組織進(jìn)一步分析,結(jié)果顯示,與配對的正常胰腺導(dǎo)管和胰腺腺泡/胰島相比較,miR-506在PDAC中均呈低表達(dá)(P0.0001)。3、在PDAC中,miR-506 ISH與qRT-PCR的結(jié)果基本一致,miR-506高表達(dá)均更多地見于較低的T分期。在PDAC與正常胰腺組織不同成分的比較中,miR-506ISH與qRT-PCR的結(jié)果不同。出現(xiàn)差異的原因可能有:一、樣本量較小。二、miR-506 ISH在TMA上完成,正常組織中的胰腺導(dǎo)管數(shù)量非常少。三、評估m(xù)iRNA ISH結(jié)果采用了半定量的方法,根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞比例的乘積進(jìn)行評分,與qRT-PCR的定量分析不同。四、最重要的可能是miR-506位于細(xì)胞漿中,與正常導(dǎo)管相比,PDAC的細(xì)胞核/漿比例變大,細(xì)胞漿較少,漿內(nèi)的miRNA相對濃度大,染色深,視覺上表達(dá)更強,結(jié)果評判受主觀影響更大。五、miRNA ISH試劑盒建議的內(nèi)參為U6,表達(dá)于細(xì)胞核,與表達(dá)于細(xì)胞漿的miR-506的匹配性存在疑問。qRT-PCR雖然不能直接與組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合,但借助LCM/手工切割獲得特定組織成分,通過定量檢測得到的結(jié)果更可信。結(jié)論:1、鑒于miRNA受組織降解的影響比較小,在福爾馬林固定、石蠟包埋組織中通過qRT-PCR的方法檢測miRNA的表達(dá)是可行的。通過LCM/手工切割獲得特定的組織成分進(jìn)行qRT-PCR,可以彌補qRT-PCR不能兼顧組織學(xué)的劣勢。2、雖然miRNA ISH能夠與形態(tài)學(xué)相結(jié)合,但是通過染色強度進(jìn)行半定量評估所得的結(jié)果在精確度上低于qRT-PCR。選擇合適的研究對象、發(fā)現(xiàn)并使用更合理的內(nèi)參、增大樣本量可能會提高miRNA ISH的檢測效力。3、建立在LCM和手工切割基礎(chǔ)上的qRT-PCR結(jié)果證實,miR-506在PDAC中的表達(dá)明顯低于正常胰腺導(dǎo)管上皮,并且其表達(dá)水平與PDAC預(yù)后不良因素呈負(fù)相關(guān),提示miR-506低表達(dá)可能與PDAC的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但仍需大樣本研究及體外實驗和動物實驗證實。 【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9

【圖文】：

組織芯片 HE 染色圖片。200 例福爾馬林固定、石蠟包埋的胰腺 113 例 PDAC 組織和 87 例切緣的正常胰腺組織，分布于 5 個組進(jìn)一步分析了 110 例 PDAC 中 miR-506 的表達(dá)水平與腫瘤分化之在高分化和中分化（低級別）的 PDAC 中，更多的病例表現(xiàn)為 m而在低分化（高級別）的 PDAC 中，miR-506 常為低表達(dá)（圖：PDAC 呈高、中分化的樣本中，miR-506 低表達(dá)的有 39 例（57. 29 例（42.6%）；而低分化的 PDAC 中，miR-506 低表達(dá)的有，高表達(dá)的僅有 9 例（21.4%）。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，在高分化AC 中 miR-506 高表達(dá)例數(shù)的比例顯著高于低分化的 PDAC 中的）。

171.2 在不同分化級別的 PDAC 中 miR-506 ISH 的代表性圖像。miR-506 ISH 在A 上完成，并以 U6 作為內(nèi)參。TMA 連續(xù)切片，分別進(jìn)行 HE 染色、U6 ISHmiR-506 ISH。miR-506 ISH 顯示，在這例高-中分化 PDAC 中 miR-506 的表達(dá)低分化的 PDAC。標(biāo)尺為 200μm。另外，T1、T2 期的患者樣本中，miR-506 低表達(dá)的有 12 例（42.9%），高表有 16 例（57.1%）；T3、T4 期的患者樣本中，miR-506 呈低表達(dá)的有 60 例3.2%），高表達(dá)的有 22 例（26.8%）。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，T1、T2 期 PDACmiR-506 高表達(dá)的比例顯著高于 T3、T4 期病例（P=0.004）。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

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本文編號：2712152