【摘要】：腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成,但目前關(guān)于腫瘤微環(huán)境的研究多注重模擬微環(huán)境中生物化學(xué)因素,忽略真實(shí)體內(nèi)生物力學(xué)因素影響,故其結(jié)果的可靠性有待證實(shí)。因此,如果能夠利用力學(xué)模型加入生物化學(xué)因素的刺激,不但能夠進(jìn)一步模擬體內(nèi)的微環(huán)境,觀察腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,還將進(jìn)一步準(zhǔn)確揭示生物化學(xué)及生物力學(xué)因素對(duì)腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,更主要的是挑戰(zhàn)傳統(tǒng)腫瘤微環(huán)境的觀點(diǎn)限制,為進(jìn)一步腫瘤治療提出新的觀點(diǎn)和手段。本研究擬借助力學(xué)模型構(gòu)建體內(nèi)腫瘤微環(huán)境,研究腎透明細(xì)胞癌微環(huán)境中淋巴細(xì)胞與腫瘤生長(zhǎng)介導(dǎo)的壓力對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的分子機(jī)制,本研究旨在為腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移及治療尋找新的治療方向,本研究分為以下三部分。研究方法:1.應(yīng)用PCR Array技術(shù)篩選腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵變化組分以及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用通過(guò)自行設(shè)計(jì)腫瘤微環(huán)境相關(guān)成分PCR Array,篩選正常腎組織與腎腫瘤組織微環(huán)境差異成分CD4;通過(guò)免疫組化、臨床隨訪、共聚焦技術(shù)以及腫瘤功能學(xué)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步篩選關(guān)鍵變化組分;為明確微環(huán)境中影響腎癌進(jìn)展的關(guān)鍵組分以及進(jìn)一步可能的機(jī)制提供依據(jù)。2.借助力學(xué)模型運(yùn)用基因表達(dá)譜技術(shù)篩選生物化學(xué)及生物力學(xué)聯(lián)合作用下微環(huán)境中促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展的關(guān)鍵蛋白基于力學(xué)模型構(gòu)建腫瘤微環(huán)境模型,運(yùn)用全基因表達(dá)譜技術(shù)驗(yàn)證生物力學(xué)因素對(duì)腫瘤影響;在此基礎(chǔ)上,加入微環(huán)境生物化學(xué)成分變化因素IL-6,進(jìn)一步構(gòu)建仿生腫瘤微環(huán)境,再現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程,為后續(xù)微環(huán)境影響腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展分子機(jī)制提供技術(shù)平臺(tái)及理論依據(jù)。3.腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展的關(guān)鍵分子及通路驗(yàn)證性研究應(yīng)用生物力學(xué)平臺(tái),驗(yàn)證基因表達(dá)譜芯片篩選出的β-catenin、CD44為代表的關(guān)鍵蛋白在腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展中的作用,進(jìn)一步證實(shí)調(diào)控關(guān)鍵蛋白的信號(hào)通路,以此為治療腎透明細(xì)胞癌提供新的思路及理論基礎(chǔ)。結(jié)果:1.應(yīng)用PCR Array技術(shù)篩選腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵變化組分以及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用通過(guò)自行設(shè)計(jì)的腫瘤微環(huán)境PCR Array,我們對(duì)比正常腎組織與腎癌組織發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中CD4及上皮間質(zhì)化(epithelial to mesenchymal transition EMT)組分變化明顯;進(jìn)一步利用免疫組化我們發(fā)現(xiàn)與低級(jí)別腎癌相比,高級(jí)別中CD4及上皮間質(zhì)化標(biāo)記物α-SMA表達(dá)明顯增高,并且兩者存在正相關(guān)性,因而我們進(jìn)一步研究?jī)烧咴谀I癌中的關(guān)系,體外流式細(xì)胞儀提取人原代CD4(+)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng),通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)液中IL-6含量變化顯著增高。然后體外IL-6刺激腎癌腫瘤細(xì)胞,通過(guò)共聚焦顯像及蛋白水平變化發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化現(xiàn)象,并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移。為明確微環(huán)境中影響腎癌進(jìn)展的關(guān)鍵組分以及進(jìn)一步可能的機(jī)制提供依據(jù)。2.借助力學(xué)模型運(yùn)用基因表達(dá)譜技術(shù)篩選生物化學(xué)及生物力學(xué)聯(lián)合作用下微環(huán)境中促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展的關(guān)鍵蛋白腫瘤微環(huán)境中不僅存在生物化學(xué)因素,還有生物力學(xué)發(fā)揮作用,我們體外構(gòu)建生物力學(xué)微環(huán)境模型,實(shí)現(xiàn)力學(xué)和化學(xué)連續(xù)動(dòng)態(tài)刺激腫瘤細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞活性及遷移實(shí)驗(yàn),明確腫瘤細(xì)胞微環(huán)境壓力范圍;在此基礎(chǔ)上,我們通過(guò)基因表達(dá)譜芯片對(duì)IL-6刺激組、生物力學(xué)刺激組及聯(lián)合作用組進(jìn)行差異基因的分析定量,同時(shí)根據(jù)GO(Gene Ontology)分析挑選出功能與上皮間質(zhì)化及生物力學(xué)相關(guān)的分子,在腎癌細(xì)胞中進(jìn)一步篩選出β-catenin關(guān)鍵蛋白,為后續(xù)微環(huán)境影響腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展分子機(jī)制提供技術(shù)平臺(tái)及理論依據(jù)。3.腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展的關(guān)鍵蛋白及通路研究選取關(guān)鍵蛋白β-catenin,借助生物力學(xué)平臺(tái)進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)β-catenin能有效影響腎癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞干性,而且與腎癌預(yù)后相關(guān)。同時(shí),我們通過(guò)全基因表達(dá)譜芯片KEGG通路篩選出PI3K-Akt信號(hào)通路,基于蛋白水平驗(yàn)證腫瘤微環(huán)境通過(guò)物理化學(xué)作用調(diào)控Akt/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路影響腎癌進(jìn)展,以此為治療腎透明細(xì)胞癌提供新的思路及理論基礎(chǔ)。結(jié)論:1.本研究成功通過(guò)自行設(shè)計(jì)的腫瘤微環(huán)境PCR Array,篩選正常腎組織與腎腫瘤組織微環(huán)境差異組分CD4;并且通過(guò)免疫組化、臨床隨訪、共聚焦技術(shù)以及腫瘤功能學(xué)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步篩選出CD4(+)T細(xì)胞分泌因子IL-6及其對(duì)腫瘤的影響。2.借助生物力學(xué)平臺(tái),明確合適的壓力水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),利用基因表達(dá)譜芯片證明壓力存在仍能進(jìn)一步加強(qiáng)IL-6作用,使腫瘤細(xì)胞惡性程度進(jìn)一步升高,但是單純的壓力不能啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化進(jìn)程。3.腫瘤微環(huán)境通過(guò)生物力學(xué)及生物化學(xué)作用調(diào)控Akt/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路影響腎癌進(jìn)展,為腎癌治療的提供新的思路。
【圖文】：

其中 21 個(gè)基因是上調(diào)的，6個(gè)基因是下調(diào)的（圖 1-1a）。繼而我們將差異基因按照功能和種類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)（圖1-1b），與正常腎臟組織相比，腫瘤組織上皮間質(zhì)化相關(guān)基因（CXCR4，VIM，，ACTA2）明顯上調(diào)；相似的，細(xì)胞外基質(zhì)以及生物力學(xué)相關(guān)基因也顯著表達(dá)升高（PLOD2，P4HA1，LOXL2，LOX

圖 1-2 對(duì) 55 位不同級(jí)別腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn) α-SMA（+）細(xì)和 CD4（+）細(xì)胞數(shù)在 Fuhrman III-IV 組織增強(qiáng)，而 Collagen I 染色強(qiáng)度在 Fuhrman III-IV織減弱。圖中比例尺 100μm，p < 0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖 1-3 Spearman 關(guān)聯(lián)分析 Collagen I 和 α-SMA（+）細(xì)胞數(shù)在腎癌組織中的關(guān)系，顯Collagen I 和 α-SMA（+）細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)，關(guān)聯(lián)系數(shù) r = -0.348， p < 0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：2711572