【摘要】：研究背景和目的:口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一。近年來(lái),新的醫(yī)療技術(shù)和治療方法不斷涌現(xiàn),有效的提高了腫瘤的局部控制率,但口腔癌患者的5年生存率并沒(méi)有下降的趨勢(shì),仍高達(dá)50-55%。該疾病的死亡率仍高居不下,其原因主要是口腔鱗癌具有局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。所以對(duì)于口腔鱗癌患者的轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究成為目前研究的重中之重,闡明腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制并且采取有效的措施遏制轉(zhuǎn)移對(duì)于改善口腔鱗癌患者的預(yù)后和治療具有重要意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是一種復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,在胚胎發(fā)生、傷口愈合和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中均具有重要的意義。它可以選擇已有的細(xì)胞電位,從而促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖、死亡,獲得特定的細(xì)胞命運(yùn)和激活分化程序,發(fā)育和維持自我更新的成人組織,因此在各種組織發(fā)育的過(guò)程中Notch扮演著關(guān)鍵作用。隨著對(duì)Notch信號(hào)通路研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)該通路與EMT有關(guān),其不僅參與了生物個(gè)體的發(fā)育過(guò)程,還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Notch信號(hào)通路的激活可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生,但是這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其與EMT在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的關(guān)系仍不清楚。因此,本研究的目的主要以口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113和CAL27為模型,探討Notch信號(hào)通路和EMT的關(guān)系及在OSCC轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。研究方法:(1)通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113和CAL27中Snail基因的表達(dá),使用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)Snail-si RNA轉(zhuǎn)染后Tca8113和CAL27細(xì)胞中Snail、E-cadherin、Vimentin基因的mRNA表達(dá)水平;同時(shí)采用Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞系中Snail、E-cadherin、Vimentin基因的蛋白表達(dá)水平;并采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn),分別檢測(cè)在Tca8113和CAL27細(xì)胞中降低Snail基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響,從而探討Snail及EMT相關(guān)基因?qū)谇击[癌的影響。(2)使用DAPT阻斷Notch信號(hào)通路,用MTT法檢測(cè)不同劑量(1?40umol/L)DAPT對(duì)Tca8113和CAL27細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力的影響;根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用1 umol/L和5 umol/L濃度的DAPT處理兩種細(xì)胞24h和48h,采用qRT-PCR方法檢測(cè)DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后兩種細(xì)胞Hes1、Snail、Vimentin和E-cadherin基因的mRNA表達(dá)水平;同時(shí)采用Western-blot檢測(cè)N1ICD、Snail、E-cadherin、Vimentin基因的蛋白表達(dá)水平;并采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后兩種細(xì)胞的遷移能力,從而探討Notch信號(hào)通路與EMT的關(guān)系及對(duì)口腔鱗癌的影響。研究結(jié)果:(1)qRT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示siRNA技術(shù)能夠有效抑制Tca8113和CAL27細(xì)胞Snail的mRNA和蛋白表達(dá)水平,同時(shí)Vimentin表達(dá)減少,而E-cadherin表達(dá)增加;同時(shí),Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,沉默Snail基因也顯著抑制了Tca8113和CAL27兩種OSCC細(xì)胞的遷移能力。(2)1umol/L、2 umol/L、5umol/L濃度的DAPT作用于Tca8113和CAL27細(xì)胞24h和48h后,對(duì)細(xì)胞的增殖率無(wú)明顯影響;而10umol/L、20 umol/L、40umol/L濃度的DAPT作用于兩種細(xì)胞24h、48h、72h、96h、120h可顯著降低細(xì)胞的增殖率,且呈現(xiàn)明顯的時(shí)間與劑量依賴關(guān)系。qRT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示,使用1 umol/L和5 umol/L的DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后,能夠下調(diào)兩種細(xì)胞Snail和Vimentin和上調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平;同時(shí),Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后Tca8113和CAL27細(xì)胞的的遷移能力明顯降低。結(jié)論:(1)抑制Snail基因在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá),細(xì)胞的遷移能力減弱;(2)Notch信號(hào)通過(guò)對(duì)EMT的調(diào)控促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。
【圖文】：

目的慢病毒載體載體名稱：GV248元件順序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin對(duì)照編號(hào)：CON077對(duì)照插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT2）慢病毒的包裝病毒包裝共涉及三個(gè)質(zhì)粒，分別為：①攜帶目的基因靶點(diǎn)序列的工具載粒；②病毒包裝輔助質(zhì)粒（Helper 1.0）；③病毒包裝輔助質(zhì)粒（Helper 2.0驗(yàn)中采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染完成后的 72h 進(jìn)行病毒收獲（即化的細(xì)胞上清液），根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，，采用相應(yīng)的濃縮純化方法以得到高滴慢病毒保存液，最后根據(jù)嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定慢病毒的各項(xiàng)指標(biāo)。慢病毒的流程如圖 1-1 所示。

2 結(jié)果2.1 Snail-siRNA 干擾對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響2.1.1 倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率慢病毒載體自帶綠色熒光蛋白 GFP 標(biāo)記的 Snail-siRNA 轉(zhuǎn)染后 96h 于倒置熒光顯微鏡下觀察GFP 標(biāo)記的 siRNA轉(zhuǎn)染情況。分別如圖 2-1和2-2所示，Tca8113 和CAL27細(xì)胞轉(zhuǎn)染率均達(dá)到 80％以上，且兩種細(xì)胞均對(duì) LV-SNAI1-RNAi(7368-1)的轉(zhuǎn)染效率最佳。
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.8

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