發(fā)布時(shí)間：2020-06-13 05:57

【摘要】：結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率逐年升高,已經(jīng)成為了世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。在我國,隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,居民生活方式的轉(zhuǎn)變,以及人口老齡化的加劇,CRC的發(fā)病和死亡均呈明顯上升的趨勢(shì),且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢(shì)。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是臨床上最常用的治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌((metastatic colorectal cancer,mCRC)的化療藥物之一,但是,固有或獲得性耐藥等因素阻礙了其充分發(fā)揮抗腫瘤作用,mCRC患者的預(yù)后仍然較差,5年生存率不到10%。因此,尋找有效的CRC治療策略具有重要的意義。聯(lián)合用藥是克服耐藥的有效方法,而對(duì)聯(lián)合作用的具體分子機(jī)制的深入理解是開發(fā)更好的聯(lián)合療法的關(guān)鍵所在。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能夠誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡,對(duì)正常組織和細(xì)胞無明顯毒性。有研究表明,細(xì)胞毒性藥物、放射線、分子靶向藥物等與TRAIL聯(lián)用能增強(qiáng)其誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,并且能逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐藥性。環(huán)化變構(gòu)TRAIL(circular permuted TRAIL,CPT)或稱為重組變構(gòu)人TRAIL(recombinant mutant human TRAIL,rmh TRAIL)是由野生型TRAIL結(jié)構(gòu)優(yōu)化而產(chǎn)生,其穩(wěn)定性、溶解性、抗腫瘤活性和安全性均優(yōu)于野生型TRAIL,研究顯示CPT對(duì)多種非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞具有顯著的抑制作用,而對(duì)人正常細(xì)胞則無毒性;CPT與順鉑(cisplatin,DDP)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NSCLC細(xì)胞系的生長抑制作用明顯加強(qiáng)或表現(xiàn)為協(xié)同作用,而對(duì)正常人細(xì)胞不表現(xiàn)明顯的毒性,體內(nèi)試驗(yàn)也得出了類似的結(jié)果。此外,多項(xiàng)研究已證明,CPT已經(jīng)成為一種有潛力的治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物。以上均顯示出CPT具有良好的抗腫瘤治療前景。然而,迄今為止,有關(guān)CPT在結(jié)直腸癌中的研究尚未見報(bào)道。在本研究中,我們首次觀察了CPT單藥及CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)人CRC細(xì)胞增殖及凋亡的作用,并對(duì)誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了探討;通過建立CRC細(xì)胞HCT116荷瘤裸鼠模型,觀察了CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)裸鼠成瘤能力的影響,并應(yīng)用TUNEL/DAPI染色法檢測了CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)CRC移植瘤細(xì)胞凋亡的影響。本研究的主要目的在于明確:(1)CPT單藥是否能夠抑制CRC細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡;(2)CPT與5-FU聯(lián)用能否增強(qiáng)抗腫瘤效果;5-FU能否增加CRC細(xì)胞對(duì)CPT的敏感性;(3)CPT與5-FU聯(lián)合抗腫瘤作用的分子機(jī)制;(4)CPT與5-FU聯(lián)用的體內(nèi)抗腫瘤效果如何。研究結(jié)果將為今后開展CPT治療CRC的臨床試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為將來臨床上應(yīng)用此聯(lián)合方案治療晚期CRC作為新的治療方式奠定基礎(chǔ)。本研究分以下三部分:第一部分環(huán)化變構(gòu)TRAIL聯(lián)合5-FU抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用目的:觀察CPT和/或5-FU對(duì)人CRC細(xì)胞HCT116和SW480體外增殖及凋亡的影響。方法:1.細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)將CRC細(xì)胞HCT116和SW480分別接種于96孔板,每株細(xì)胞分為不同濃度的5-FU組和不同濃度的CPT組,待24h細(xì)胞過夜貼壁后,分別用不同濃度的5-FU處理48h,用不同濃度的CPT處理12、24或48h。然后加入MTS,繼續(xù)培養(yǎng)3h,用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD值),根據(jù)公式計(jì)算出各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率,進(jìn)一步得到半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),IC50為細(xì)胞生長抑制達(dá)50%時(shí)的藥物濃度。CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)CRC細(xì)胞的增殖抑制作用:將CRC細(xì)胞HCT116和SW480分別接種于96孔板,待24h細(xì)胞貼壁后,HCT116細(xì)胞用5μg/mL的5-FU聯(lián)合不同濃度的CPT共同作用48h;SW480細(xì)胞用12.5μg/mL的5-FU聯(lián)合不同濃度的CPT共同作用48h,然后加入MTS繼續(xù)培養(yǎng)3h,用酶標(biāo)儀檢測各孔OD值,根據(jù)公式計(jì)算出兩株CRC細(xì)胞的增殖抑制率。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測兩株CRC細(xì)胞的凋亡率將CRC細(xì)胞HCT116和SW480以5×10~5個(gè)/孔的密度分別接種于6孔板,每株細(xì)胞分為六組:對(duì)照組、5-FU組、CPT低濃度組、CPT高濃度組、5-FU+CPT低濃度組和5-FU+CPT高濃度組,細(xì)胞過夜貼壁后分別加入CPT和/或5-FU處理24h或48h,收集細(xì)胞,用Annexin V-FITC和PI雙染細(xì)胞,室溫下避光反應(yīng)5分鐘,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:1.CPT或5-FU單藥對(duì)兩株CRC細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用MTS結(jié)果顯示:不同濃度的5-FU單藥分別作用于CRC細(xì)胞HCT116和SW480 48h,能明顯抑制兩株細(xì)胞的增殖,細(xì)胞的增殖抑制率隨5-FU濃度的增大而增加,呈濃度依賴效應(yīng)(P0.001)。不同濃度的CPT單藥分別作用于CRC細(xì)胞HCT116和SW480 12、24或48h,MTS結(jié)果顯示:CPT單藥對(duì)CRC細(xì)胞HCT116和SW480具有明顯的增殖抑制作用,隨著CPT濃度的增大,細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加,隨著作用時(shí)間的延長,細(xì)胞的增殖抑制率也增加,呈時(shí)間和濃度依賴效應(yīng)(P0.001)。在48h,CPT對(duì)CRC細(xì)胞HCT116和SW480的IC50值分別為8.49 ng/mL和338.43 ng/mL。2.CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)兩株CRC細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)CPT與5-FU聯(lián)合作用于CRC細(xì)胞HCT116和SW480 48h,結(jié)果顯示,聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單藥CPT或5-FU組,差異均有顯著性(P0.001)。3.5-FU能增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡的作用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,無論5-FU還是CPT單藥均能誘導(dǎo)CRC細(xì)胞HCT116和SW480凋亡;當(dāng)CPT與5-FU聯(lián)用時(shí),兩株細(xì)胞的凋亡率均明顯高于單藥組,差異均有顯著性(P0.05)。兩株細(xì)胞在CPT高濃度組的凋亡率高于低濃度組,差異均有顯著性(P0.05)。各藥物處理組細(xì)胞在48h的凋亡率均高于24h的凋亡率,差異均有顯著性(P0.05)。小結(jié):1.CPT單藥能抑制CRC細(xì)胞HCT116和SW480增殖,且增殖抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴效應(yīng);5-FU單藥對(duì)CRC細(xì)胞HCT116和SW480具有明顯的增殖抑制作用,呈濃度依賴效應(yīng);2.CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)CRC細(xì)胞HCT116和SW480的增殖抑制作用顯著增強(qiáng);3.CPT單藥能誘導(dǎo)CRC細(xì)胞HCT116和SW480發(fā)生凋亡;CPT與5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)CRC細(xì)胞HCT116和SW480凋亡的作用明顯增強(qiáng)。第二部分環(huán)化變構(gòu)TRAIL聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡機(jī)制探討目的:探討CPT聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)人CRC細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法:1.Western blot法檢測CPT聯(lián)合5-FU對(duì)CRC細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響將CRC細(xì)胞HCT116和SW480分別以5×10~5個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,每株細(xì)胞分四組:對(duì)照組、5-FU組、CPT組、5-FU+CPT組,細(xì)胞過夜貼壁后分別加入5-FU和/或CPT處理48h,然后裂解細(xì)胞收集蛋白,行蛋白定量,用10%SDS-PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗4℃過夜孵育、二抗常溫孵育1.5h,用ECL試劑進(jìn)行顯色,采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK對(duì)CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡的影響應(yīng)用廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK分別處理CRC細(xì)胞HCT116和SW480 1h后,各實(shí)驗(yàn)組加入CPT或CPT聯(lián)合5-FU繼續(xù)作用48h,收集細(xì)胞,用Annexin V-FITC和PI雙染細(xì)胞,室溫下避光反應(yīng)5min,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。3.Western blot法檢測廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK對(duì)CPT或CPT聯(lián)合-5FU誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK分別處理CRC細(xì)胞HCT116和SW480 1h后,各實(shí)驗(yàn)組加入CPT或CPT聯(lián)合5-FU繼續(xù)作用48h,然后裂解細(xì)胞收集蛋白,行蛋白定量,用10%SDS-PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗4℃過夜孵育、二抗常溫孵育1.5h,用ECL試劑進(jìn)行顯色,采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)凋亡信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響1.1 CPT與5-FU聯(lián)用能誘導(dǎo)CRC細(xì)胞發(fā)生caspase依賴性的凋亡Western blot結(jié)果顯示,CPT單藥能導(dǎo)致兩株CRC細(xì)胞中caspase-3、caspase-8和PARP的表達(dá)水平下降,而使cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP的裂解片段表達(dá)水平升高;與CPT單藥組相比,聯(lián)合用藥組兩株細(xì)胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP的裂解片段表達(dá)水平明顯升高。另外,CPT與5-FU聯(lián)用能導(dǎo)致兩株CRC細(xì)胞中caspase-9的表達(dá)水平下降,但沒有檢測到裂解形式的caspase-9的表達(dá)。1.2 5-FU作用于CRC細(xì)胞能引起死亡受體(DRs)的表達(dá)上調(diào)不同濃度的5-FU分別作用于CRC細(xì)胞HCT116和SW480 48h,應(yīng)用Western blot法檢測死亡受體4(DR4)和DR5的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:5-FU能明顯上調(diào)HCT116細(xì)胞中DR4和DR5的表達(dá),而在SW480細(xì)胞,5-FU只能引起DR4的表達(dá)上調(diào),與對(duì)照組相比差異均有顯著性(P0.001)。1.3 CPT與5-FU聯(lián)用能下調(diào)CRC細(xì)胞Bcl-XL的表達(dá)水平CPT和/或5-FU作用于CRC細(xì)胞HCT116和SW480 48h后,用Western blot法檢測BAX、Bcl-XL和XIAP蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:CPT與5-FU聯(lián)用使Bcl-XL的表達(dá)水平下降,而對(duì)BAX和XIAP的表達(dá)水平無明顯影響。2.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能抑制CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能明顯抑制CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)的兩株CRC細(xì)胞凋亡。HCT116細(xì)胞加或不加z-VAD-FMK處理,CPT組的凋亡率分別為16.3±0.4%和59.9±0.9%,CPT聯(lián)合5-FU組的凋亡率分別為33.6±2.4%和90.8±0.8%,差異均有顯著性(P0.001);SW480細(xì)胞加或不加z-VAD-FMK處理,CPT組的凋亡率分別為18.9±0.5%和43.7±0.2%,CPT聯(lián)合5-FU組的凋亡率分別為29.7±0.2%和69.6±0.9%,差異均有顯著性(P0.001)。3.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能夠阻斷CRC細(xì)胞中凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)Western blot結(jié)果顯示:CPT單藥或CPT與5-FU聯(lián)用能明顯上調(diào)cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP蛋白的裂解片段在CRC細(xì)胞HCT116和SW480中的表達(dá),當(dāng)加入z-VAD-FMK后,這種裂解作用明顯受到抑制。結(jié)果表明,CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡是caspase依賴性的。小結(jié):1.CPT及CPT與5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡是caspase依賴性的;2.5-FU通過上調(diào)DRs的表達(dá)及下調(diào)Bcl-XL的表達(dá)來增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡的作用及增加CRC細(xì)胞對(duì)CPT的敏感性;3.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能顯著抑制CPT單藥或CPT與5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡;4.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能使cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP蛋白的裂解片段表達(dá)水平明顯下降,有效阻斷了caspase介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);5.Caspase家族蛋白酶在CPT及CPT聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡中起了關(guān)鍵作用。第三部分環(huán)化變構(gòu)TRAIL聯(lián)合5-FU體內(nèi)抗腫瘤作用目的:建立人CRC荷瘤裸鼠模型,觀察CPT與5-FU聯(lián)用在體內(nèi)的抗腫瘤效果。方法:1.建立CRC細(xì)胞HCT116荷瘤裸鼠模型取處于對(duì)數(shù)生長期的CRC細(xì)胞HCT116,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10~7個(gè)/mL,接種于6周齡雌性BALB/C裸鼠右側(cè)腋窩中部皮下,每只裸鼠接種6×10~6個(gè)細(xì)胞。待腫瘤生長至100-120mm~3時(shí),隨機(jī)分為5組,每組5只裸鼠,并給藥處理,自用藥當(dāng)天開始,每5天測量裸鼠體重、并測量瘤徑,按公式計(jì)算腫瘤體積,瘤體積=1/2×長徑×短徑~2。第25天,處死裸鼠,剝?nèi)×鼋M織稱重并拍照。每只裸鼠的腫瘤組織分為兩份,一份保存于液氮,另一份用30%蔗糖溶液浸泡后制成冰凍切片。2.TUNEL/DAPI法檢測裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡情況用冰凍切片機(jī)連續(xù)切片,每片3μm,然后進(jìn)行TUNEL/DAPI染色,最后利用激光共聚焦顯微鏡觀察裸鼠移植瘤的細(xì)胞凋亡情況,并拍照。結(jié)果:1.CPT聯(lián)合5-FU對(duì)荷瘤裸鼠生長狀態(tài)的影響實(shí)驗(yàn)過程中,荷瘤裸鼠精神狀態(tài)良好,生長狀態(tài)良好,飲食及活動(dòng)正常;裸鼠腫瘤表面皮膚無潰爛,各組動(dòng)物均無死亡,各組裸鼠體重間無明顯的差別(P0.05)。表明CPT和5-FU無論單獨(dú)用藥還是兩者聯(lián)合對(duì)荷瘤裸鼠均未引起明顯的不良反應(yīng),耐受良好。2.CPT聯(lián)合5-FU對(duì)人CRC荷瘤裸鼠皮下移植瘤的生長抑制作用CPT和5-FU單藥均能抑制裸鼠移植瘤的生長,與對(duì)照組比較差異均有顯著性(P0.001),而兩藥聯(lián)合對(duì)裸鼠移植瘤的生長抑制作用更加顯著,并且以高濃度的CPT(7.5mg/kg)與5-FU聯(lián)合組最為顯著,與其它組比較差異有顯著性(P0.001),且兩聯(lián)合組之間差異也有顯著性(P0.01)。3.CPT聯(lián)合5-FU促進(jìn)了荷瘤裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡TUNEL/DAPI染色法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:CPT、5-FU及CPT聯(lián)合5-FU均能導(dǎo)致裸鼠移植瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,但聯(lián)合組誘導(dǎo)凋亡的作用顯著強(qiáng)于單藥組(P0.001),并且高濃度的CPT與5-FU聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡的作用最為顯著。小結(jié):1.CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)CRC細(xì)胞HCT116荷瘤裸鼠的腫瘤具有顯著的生長抑制作用,并且高濃度CPT與5-FU聯(lián)用抑制腫瘤生長的作用更強(qiáng);荷瘤裸鼠對(duì)該用藥方案耐受性良好,無明顯不良反應(yīng)發(fā)生;2.CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)CRC細(xì)胞HCT116荷瘤裸鼠的腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用。結(jié)論:1.CPT單藥在體外能抑制CRC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡;CPT與5-FU聯(lián)用能增強(qiáng)對(duì)CRC細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用;2.CPT及CPT與5-FU聯(lián)用誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡是caspase依賴性的;3.5-FU通過上調(diào)DRs的表達(dá)及下調(diào)Bcl-XL的表達(dá)來增強(qiáng)CPT誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡的作用及增加CRC細(xì)胞對(duì)CPT的敏感性;4.CPT單藥能抑制CRC荷瘤裸鼠移植瘤的生長,CPT與5-FU聯(lián)用對(duì)裸鼠移植瘤的生長抑制作用明顯增強(qiáng);CPT與5-FU聯(lián)用促進(jìn)了CRC荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

32同濃度 5-FU 對(duì) CRC 細(xì)胞 HCT116 和 SW480 的增lorectal cancer cell lines HCT116 and SW480 were tre concentrations of 5-FU for 48 h, after which the MTSperformed to evaluate cell proliferation inhibition rate

33同濃度 CPT 對(duì) CRC 細(xì)胞 HCT116 和 SW480 的增T116 and SW480 cells were treated with various doed for 12, 24, or 48 h. Then, the MTS assay was perfhe cell proliferation inhibition rate.△P<0.001 versufor 12 h;#P<0.001 versus cells treated for 12 or 24 h
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2710755