【摘要】：[目的]MiR-637對肝細(xì)胞癌及腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的抑制作用已有報(bào)道,miR-637被報(bào)道在膽管癌組織中低表達(dá),miR-637對膽管癌的功能作用及機(jī)制研究鮮見報(bào)道。生物信息軟件預(yù)測miR-637對CTSB有調(diào)控可能,前期質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)膽管癌組織CTSB較癌旁組織表達(dá)明顯增高(8.4倍),CTSB被報(bào)道在人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用,在膽管癌組織及血液中均高表達(dá),與膽管癌分期、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)想通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-637是否對膽管癌細(xì)胞增殖、遷移存在調(diào)控作用,是否通過功能的和直接的靶向調(diào)控CTSB發(fā)揮對膽管癌細(xì)胞活力的抑制作用。[方法]在實(shí)驗(yàn)中,我們使用qRT-PCR方法檢測了miR-637在膽管癌細(xì)胞系與正常膽管上皮細(xì)胞的表達(dá),檢測人類膽管癌組織相對于癌旁組織的表達(dá)。選取表達(dá)明顯下調(diào)的QBC939細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)研究。通過慢病毒感染miR-637至膽管癌細(xì)胞QBC939,并通過熒光率驗(yàn)證感染效率。分別用MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞分析、Westblot來檢測細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞凋亡、周期以及對凋亡蛋白Caspase 3與Caspase 9表達(dá)的影響。通過生物信息軟件預(yù)測CTSB為miR-637可能調(diào)控的備選靶基因。使用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證共轉(zhuǎn)染miR-637 mimics與野生型CTSB組熒光率是否較空白對照及mut組顯著降低。RT-PCR和Western blot分別從基因與蛋白層面檢測過表達(dá)mi R-637對CTSB的表達(dá)的影響。RT-PCR法對41例膽管癌標(biāo)本的miR-637及CTSB mRNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析,進(jìn)一步驗(yàn)證miR-637是否存在與CTSB mRNA的負(fù)性相關(guān)性。[結(jié)果]膽管癌細(xì)胞系(QBC939、RBE、HuCCT1)的miR-637水平均顯著高于膽管上皮細(xì)胞(HIBEpiC),而QBC939細(xì)胞表達(dá)水平高于其他幾種膽管癌細(xì)胞,膽管癌組織miR-637表達(dá)較癌旁組織顯著升高。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):RT-PCR法顯示膽管癌細(xì)胞QBC939 miR-637的表達(dá)豐度為低。慢病毒轉(zhuǎn)染mi R-637至QBC939細(xì)胞72小時(shí)顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)正常,轉(zhuǎn)染效率(熒光率)70-80%。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-637組膽管癌細(xì)胞的增殖活力顯著下降,劃痕實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-637抑制了膽管癌細(xì)胞的遷移,流式細(xì)胞分析顯示過表達(dá)miR-637促進(jìn)了膽管癌細(xì)胞的凋亡,阻滯了膽管癌細(xì)胞周期。Westblot發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-637促進(jìn)了Caspase 3與Caspase 9的表達(dá)。通過Targetscan數(shù)據(jù)庫分析得知CTSB為miR-637備選靶基因,通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明:共轉(zhuǎn)染野生型miR-637mimic與CTSB組較mut組與空白對照組熒光率顯著降低。RT-PCR及Westblot顯示過表達(dá)miR-637組細(xì)胞CTSB mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著降低。對41例膽管癌組織的miR-637與CTSB mRNA表達(dá)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):mi R-637水平與CTSB mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:mi R-637可能通過結(jié)合CTSB 5’UTR端調(diào)控CTSB的表達(dá)而抑制膽管癌細(xì)胞的增殖與活力。miR-637可能通過上調(diào)凋亡蛋白表達(dá)促進(jìn)了膽管癌細(xì)胞的凋亡。綜上所述,miR-637在膽管癌的病理演變中扮演重要的角色。目的:研究sh RNA對CTSB干擾效果以及Cathepsin B(CTSB)在人類膽管癌(CCA)細(xì)胞QBC939增殖、遷移、凋亡及細(xì)胞周期的作用。材料與方法:通過構(gòu)建和包裝CTSB-sh RNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞,測定sh RNA對CTSB的感染和干擾效率,檢測sh RNA干擾對QB939細(xì)胞CTSB增殖、遷移能力、凋亡以及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果:sh RNA干擾QBC939細(xì)胞CTSB m RNA的表達(dá)較QBC939-NC細(xì)胞(空白質(zhì)粒干擾細(xì)胞)顯著降低。CTSB干擾導(dǎo)致QBC939細(xì)胞增殖及遷移能力顯著降低。另外,CTSB干擾使細(xì)胞更多的停留于G0/1期,G2/M期的細(xì)胞受到阻滯。結(jié)論:CTSB對CCA細(xì)胞增殖與遷移起到重要作用。sh RNA顯著抑制了CTSB的表達(dá),從而顯著降低了QBC939細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力,使細(xì)胞更多的停留在G0/1期,并促進(jìn)了QBC939細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

18 iR-637 表達(dá)量最低的 QBC939 細(xì)胞進(jìn)行下游. A.41 例人類膽管癌組織（T）miR-637 表達(dá)較癌旁組織（P低(*p<0.05)B.膽管癌細(xì)胞系 QBC939、RBE、HuCCT1 較上皮細(xì)胞 HIBEpiC miR-637 相對表達(dá)量顯著降低(*p<0.05

感染后72小時(shí)熒光拍照，感染后細(xì)胞狀態(tài)正常
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.8

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本文編號：2709920