【摘要】：研究背景:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,在泌尿系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)導(dǎo)致男性死亡的第二位,手術(shù)切除腫瘤后2年內(nèi),大部分患者會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前針對(duì)膀胱癌的診療手段效果有限,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍然是嚴(yán)重影響膀胱癌患者預(yù)后及生活質(zhì)量的主要原因。腫瘤干細(xì)胞研究的結(jié)果顯示其可以解釋為何在重重防護(hù)措施之下,腫瘤仍然能進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及出現(xiàn)獲得性耐藥。膀胱癌干細(xì)胞的靶向治療能夠?yàn)榘螂装┗颊咛峁┮环N新的治療思路,很有可能成為治愈膀胱癌的關(guān)鍵。B7-H3是新發(fā)現(xiàn)的一種T細(xì)胞輔助刺激因子,其在腫瘤免疫過程中發(fā)揮的作用尚存在爭(zhēng)論,但其作為一種新的腫瘤相關(guān)抗原已被證實(shí)在多種上皮惡性腫瘤中異常表達(dá),如前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、卵巢癌等,且已有研究證實(shí)B7-H3參與調(diào)控腫瘤生物學(xué)功能,與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本課題擬對(duì)比膀胱癌患者腫瘤病灶B7-H3表達(dá)量與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系,進(jìn)一步在細(xì)胞和動(dòng)物水平,應(yīng)用分子生物學(xué)方法研究B7-H3是否能通過調(diào)控膀胱癌干細(xì)胞功能影響膀胱癌的復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移,為膀胱癌干細(xì)胞治療探尋潛在靶點(diǎn)。研究目的:研究B7-H3與膀胱癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其對(duì)膀胱癌干細(xì)胞的影響。研究方法:1.收集156例膀胱癌患者腫瘤組織,包括72例在2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、并行二次手術(shù)的膀胱癌患者(首次手術(shù)標(biāo)本和二次手術(shù)標(biāo)本),一半制成蠟塊,一半抽提組織液。運(yùn)用免疫組化(Immunohistochemistry)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)B7-H3在復(fù)發(fā)的膀胱癌患者與未復(fù)發(fā)的膀胱癌患者中的表達(dá)情況。2.通過免疫磁珠分選的方法利用CD44和CD20抗體標(biāo)記分選得到膀胱癌細(xì)胞株T24,BIU-87和5637干細(xì)胞富集群CD20-CD44+細(xì)胞群,RT-PCR驗(yàn)證干細(xì)胞標(biāo)志物CD44,CD20,CD133,Oct4和Bmi-1的表達(dá),裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)通過連續(xù)稀釋法驗(yàn)證干細(xì)胞的強(qiáng)大的致瘤能力,收集三對(duì)三干細(xì)胞與非干細(xì)胞進(jìn)行基因測(cè)序,RT-PCR驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。3.運(yùn)用B7-H3沉默慢病毒和陰參懸浮轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞T24干細(xì)胞側(cè)群,經(jīng)過嘌呤霉素篩選得到B7-H3穩(wěn)定沉默的T24 CD20-CD44+細(xì)胞(B7-H3 KD CSCs)和對(duì)照組T24 CD20-CD44+細(xì)胞(NC CSCs)。m RNA水平(RT-PCR),蛋白水平(Western Blot)和細(xì)胞熒光(Cell fluorescence)三者協(xié)同驗(yàn)證慢病毒懸浮轉(zhuǎn)染效率。懸浮培養(yǎng)行腫瘤微球體形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn),觀察B7-H3對(duì)膀胱癌干細(xì)胞自我更新、致瘤性和侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。4.收集荷瘤小鼠腫瘤組織提取原代細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞功能試驗(yàn),研究B7-H3沉默干細(xì)胞所形成的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性是否與干細(xì)胞特性改變一致。結(jié)果:1.B7-H3在膀胱癌復(fù)發(fā)組陽性率達(dá)79.2%,顯著高于未復(fù)發(fā)組的53.6%,P0.05。且ELISA結(jié)果顯示行二次手術(shù)的復(fù)發(fā)腫瘤灶的表達(dá)量(158.26±8.13 ng/ml)明顯高于首次手術(shù)標(biāo)本(67.45±5.68 ng/ml),P0.05。在膀胱癌復(fù)發(fā)患者二次手術(shù)腫瘤組織中,B7-H3與干細(xì)胞標(biāo)志物CD44存在共表達(dá)關(guān)系,P0.05。2.免疫磁珠分選得到的CD20-CD44+細(xì)胞群證實(shí)為膀胱癌細(xì)胞系干細(xì)胞富集群,具有自我更新和強(qiáng)大的成瘤性�；蛐酒Y(jié)果和RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果共同顯示在三組膀胱癌干細(xì)胞系中,B7-H3在干細(xì)胞側(cè)群中顯著高表達(dá),P0.05。3.RT-PCR,WB和細(xì)胞熒光共同驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染效率,B7-H3 KD CSCs細(xì)胞B7-H3表達(dá)穩(wěn)定降低約4倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。懸浮培養(yǎng)14-21天,膀胱癌干細(xì)胞的自我更新能力在B7-H3 KD組明顯減弱,NC組腫瘤微球體在腫瘤球數(shù)量、直徑及生長(zhǎng)速率方面均領(lǐng)先沉默組,P0.05。同時(shí),對(duì)比NC組,B7-H3 KD組干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下調(diào),P0.05。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:和對(duì)照組相比,B7-H3沉默時(shí),干細(xì)胞形成的腫瘤灶相對(duì)較小,生長(zhǎng)能力較弱,肝臟出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病灶數(shù)量較少,肺臟甚至肉眼未觀察到轉(zhuǎn)移灶,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.從裸鼠移植瘤抽提原代細(xì)胞,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B7-H3 KD組原代腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯弱于NC組原代細(xì)胞,P0.05;加入THP化療藥物處理24小時(shí),流式結(jié)果顯示NC組原代細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的藥物耐受能力,B7-H3 KD組原代細(xì)胞凋亡增多,對(duì)藥物敏感性較好。結(jié)論:B7-H3與臨床膀胱癌患者復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān),B7-H3在膀胱癌干細(xì)胞中高表達(dá),顯著加強(qiáng)干細(xì)胞的自我更新能力,調(diào)控腫瘤惡性生物行為,促進(jìn)膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移,可能通過調(diào)控干細(xì)胞功能參與膀胱癌復(fù)發(fā)和進(jìn)展。靶向干預(yù)B7-H3可以作為膀胱癌干細(xì)胞治療新的方向,為臨床早期診斷膀胱癌復(fù)發(fā)高危風(fēng)險(xiǎn)及指導(dǎo)預(yù)后治療提供新策略。
【圖文】：

圖 1. 免疫組化檢測(cè)復(fù)發(fā)膀胱癌中 B7-H3 表達(dá)，左圖為低表達(dá)，右圖為高表達(dá)。圖 2. 免疫組化檢測(cè)復(fù)發(fā)膀胱癌中 CD44 表達(dá)，左圖為低表達(dá)，右圖為高表達(dá)。討 論膀胱癌是全世界威脅男性健康最主要的惡性腫瘤之一，在我國(guó)也是位居男性最常見泌尿系統(tǒng)腫瘤的前列，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，由于其具有易復(fù)發(fā)性，膀胱癌患者的治療周期較長(zhǎng)，患者承受的經(jīng)濟(jì)壓力和心理壓力均較大，給患者個(gè)人、家庭和

圖 2. 免疫組化檢測(cè)復(fù)發(fā)膀胱癌中 CD44 表達(dá)，左圖為低表達(dá)，右圖為高表達(dá)討 論膀胱癌是全世界威脅男性健康最主要的惡性腫瘤之一，在我國(guó)也是位居男性最尿系統(tǒng)腫瘤的前列，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，由于其具有易復(fù)發(fā)性，膀胱的治療周期較長(zhǎng)，患者承受的經(jīng)濟(jì)壓力和心理壓力均較大，給患者個(gè)人、家庭都造成了巨大的負(fù)擔(dān)[52]。膀胱癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2709897