【摘要】：1.研究背景前列腺癌是全球男性癌癥死亡率較高的癌癥之一。盡管早期前列腺癌預(yù)后較好甚至可以治愈,但是高級(jí)別轉(zhuǎn)移性前列腺癌的男性患者平均生存時(shí)間小于2年。早期前列腺癌的首選治療方式是根治性手術(shù),而轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者經(jīng)內(nèi)分泌治療失效后繼而進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)后,化療將成為一種重要治療方式。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是廣譜抗腫瘤藥物,是公認(rèn)的治療去勢(shì)抵抗性前列腺癌,能有效延長(zhǎng)患者總生存期的一線用藥。然而,即使在各種輔助用藥的幫助下,去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者經(jīng)紫杉醇及其衍生物多西他賽(docetaxel)等藥物治療后一方面副作用較明顯,另一方面大多也會(huì)產(chǎn)生耐藥性,腫瘤進(jìn)展加快。此時(shí)患者只能尋求阿比特龍(Abiraterone acetate)等藥物治療,然而阿比特龍費(fèi)用高昂,相當(dāng)一部分患者難以承受。因此,研發(fā)能增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌的治療效果并減少紫杉醇用量的藥物非常重要。以桑色素(morin)為代表的多種黃酮類化合物(flavonoids)具有抗腫瘤作用,在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病等多種惡性腫瘤中能夠調(diào)控細(xì)胞存活、增殖以及凋亡相關(guān)的基因,促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路,并能夠增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。有研究者報(bào)道桑色素處理LNcap細(xì)胞后腫瘤細(xì)胞凋亡水平顯著增高。在乳腺癌中,桑色素也能夠有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型。同時(shí),在多項(xiàng)研究中,研究者們發(fā)現(xiàn)包括桑色素在內(nèi)的多種黃酮類化合物與紫杉醇類聯(lián)用能夠增強(qiáng)紫杉醇的抗癌作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)中,桑色素聯(lián)合紫杉醇口服給藥能夠顯著改善紫杉醇的藥效動(dòng)力學(xué),增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤效果。芹菜素、柚皮素、黃芩苷、槲皮素和楊梅素等多種黃酮類化合物,與多西他賽聯(lián)合口服給藥時(shí)能增強(qiáng)多西他賽的生物利用度。而另一種新型黃酮類化合物VCN-2能夠抑制LNcap、DU145和PC-3細(xì)胞的增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,而且其與多西他賽聯(lián)用時(shí)效果顯著強(qiáng)于單用任意一種,這種作用在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中更為顯著。而且,桑色素等黃酮類化合物在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的安全性。然而,總體而言,桑色素等藥物在前列腺癌中的作用仍研究有限,作用機(jī)制也尚不明確。2.研究目的本研究擬探索桑色素能否增強(qiáng)紫杉醇治療前列腺癌的效果。研究證實(shí)桑色素能夠增強(qiáng)紫杉醇的抗癌作用后,進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。3.方法選擇前列腺癌細(xì)胞系DU145和PC-3作為研究對(duì)象。分別在體外、體內(nèi)條件下,研究桑色素對(duì)紫杉醇治療前列腺癌效果的影響及其分子機(jī)制。3.1體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究桑色素對(duì)紫杉醇化療前列腺癌細(xì)胞效果的影響(1)分別用不同濃度(0、10 μM、20 μM、50μM)桑色素聯(lián)合同等濃度(50 nM,50 nmol/L)紫杉醇處理 DU145 細(xì)胞和 PC-3 細(xì)胞,以 DMSO(Dimethyl Sulphoxide,二甲基亞砜,溶劑)處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,通過(guò)流式細(xì)胞儀以AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。選定理想的桑色素作用濃度。(2)同等濃度桑色素聯(lián)合不同濃度(0-100 nM)紫杉醇處理DU145和PC-3細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡水平。研究桑色素對(duì)于不同濃度的紫杉醇抗腫瘤效果的影響。(3)以DU145細(xì)胞建立荷瘤裸鼠模型,研究桑色素在體內(nèi)對(duì)紫杉醇治療前列腺癌效果的影響。將20只雄性裸鼠隨機(jī)分為4組,每組5只,雙側(cè)肩背部皮下接種等量DU145細(xì)胞后,通過(guò)尾靜脈注射給藥,分別為:①DMSO、②紫杉醇、③桑色素、④紫杉醇+桑色素,以DMSO注射組作為空白對(duì)照。腫瘤種植25天后頸椎脫臼法處死裸鼠,完整切除腫瘤并拍照、稱重。3.2體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究桑色素增強(qiáng)紫杉醇治療前列腺癌效果的分子機(jī)制(1)篩選桑色素的目的miRNA:①通過(guò)miRNA芯片(miRNA microarray)技術(shù),檢測(cè)桑色素處理的DU145細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜的變化,篩選miRNA芯片的結(jié)果中差異顯著的miRNA;②通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))在DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞中驗(yàn)證,選定miR-155作為主要研究對(duì)象;③構(gòu)建miR-155沉默的DU145、PC-3細(xì)胞株和miR-155過(guò)表達(dá)的DU145、PC-3細(xì)胞株以備研究。(2)研究miR-155對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響:①紫杉醇處理miR-155沉默或過(guò)表達(dá)的DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞,以DMSO處理陰性轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照,以紫杉醇處理陰性轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為組內(nèi)對(duì)照,檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡水平;②紫杉醇聯(lián)用桑色素處理miR-155過(guò)表達(dá)的DU145和PC-3細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡水平,進(jìn)一步驗(yàn)證。(3)篩選miR-155的下游靶基因:①通過(guò)Targetscan和miRWalk靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)miR-155的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)合芯片檢測(cè)及qRT-PCR檢測(cè),篩選miR-155潛在靶基因;②采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì) miR-155 潛在靶點(diǎn) GATA3(GATA binding protein 3,GATA結(jié)合蛋白3)基因進(jìn)行驗(yàn)證;③蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)miR-155 對(duì) GATA3 蛋 白表達(dá)水平的影響。(4)檢測(cè)GATA3基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞增殖和凋亡的影響:①檢測(cè)前列腺癌癌旁正常組織和腫瘤組織中GATA3的mRNA表達(dá)水平;②DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞沉默或過(guò)表達(dá)GATA3,以陰性轉(zhuǎn)染為對(duì)照,經(jīng)紫杉醇處理后檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡水平。(5)研究桑色素通過(guò)miR-155對(duì)GATA3表達(dá)水平的調(diào)控作用:①體外實(shí)驗(yàn),Western blot檢測(cè)藥物處理對(duì)DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞中GATA3表達(dá)水平的影響;②檢測(cè)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中各組裸鼠腫瘤GATA3表達(dá)水平。3.3免疫組化檢測(cè)選取Ki67、cleaved caspase-3、GATA3在裸鼠腫瘤中行免疫組化檢測(cè),驗(yàn)證桑色素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和靶基因表達(dá)水平的影響。3.4數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS version 13.0(IBM,Armonk,NY,USA)軟件分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組數(shù)據(jù)之間的差異比較采用單因素或雙因素方差分析。兩組數(shù)據(jù)之間的差異比較采用T檢驗(yàn)分析。p值0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.結(jié)果4.1桑色素在體外增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞的化療效果(1)分別以0、10μM、20μM、50 μM桑色素聯(lián)合50 nM紫杉醇處理DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞時(shí),50 μM桑色素作用于兩種細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡效果最為顯著。選取50 μM為本研究中桑色素的作用濃度。(2)50μM桑色素與不同濃度紫杉醇聯(lián)用處理DU145和PC-3細(xì)胞,能夠顯著降低這兩種細(xì)胞的活力,增加細(xì)胞的凋亡水平。4.2桑色素在體內(nèi)增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞的化療效果在前列腺癌細(xì)胞DU145建立的荷瘤裸鼠模型中,桑色素聯(lián)合紫杉醇處理能夠使腫瘤生長(zhǎng)速度顯著減緩,增強(qiáng)紫杉醇在體內(nèi)的抗腫瘤作用。4.3桑色素抑制前列腺癌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)(1)芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在桑色素處理后的DU145細(xì)胞中有39種miRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比存在明顯差異,其中以miR-155的差異最為顯著。(2)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)桑色素處理的DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。4.4沉默miR-155增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞的化療效果,過(guò)表達(dá)miR-155抑制紫杉醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞的化療效果并逆轉(zhuǎn)桑色素對(duì)紫杉醇化療效果的增強(qiáng)作用(1)轉(zhuǎn)染anti-miR-155沉默miR-155后,DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞經(jīng)紫杉醇處理,以陰性轉(zhuǎn)染為對(duì)照,細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組,凋亡水平顯著高于對(duì)照組。(2)轉(zhuǎn)染miR-155 mimics過(guò)表達(dá)miR-155后,DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞經(jīng)紫杉醇處理,以陰性轉(zhuǎn)染為對(duì)照,細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組,凋亡水平顯著低于對(duì)照組。(3)陰性轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞經(jīng)桑色素聯(lián)合紫杉醇處理,細(xì)胞活力顯著低于單用紫杉醇組,凋亡水平顯著高于單用紫杉醇組。過(guò)表達(dá)miR-155的DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞經(jīng)桑色素聯(lián)合紫杉醇處理后,細(xì)胞活力顯著高于陰性轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞,凋亡水平顯著低于陰性轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞。4.5 GATA3基因是miR-155的下游靶基因,表達(dá)受miR-155調(diào)控(1)以Targetscan和miRWalk對(duì)miR-155潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)合芯片結(jié)果中桑色素處理后差異表達(dá)的基因,在5348個(gè)差異表達(dá)的基因中,PAK2、XRN1以及GATA3最有可能是miR-155的靶基因。(2)qRT-PCR檢測(cè),在mi R-155過(guò)表達(dá)的DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞中PAK2、XRN1、GATA3的表達(dá)水平均受到不同程度的抑制。miR-155過(guò)表達(dá)對(duì)GATA3抑制顯著強(qiáng)于對(duì)PAK2和XRN1的抑制作用,因此選取GATA3基因進(jìn)一步研究。(3)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),GATA3是miR-155的靶基因。(4)Western blot檢測(cè),在兩種前列腺癌細(xì)胞中,沉默miR-155可增加GATA3表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-155可抑制GATA3表達(dá)。4.6前列腺癌組織中GATA3表達(dá)顯著低于癌旁正常組織,桑色素在體外和體內(nèi)能上調(diào)GATA3基因的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤效果(1)檢測(cè)15例前列腺癌癌旁正常組織和33例前列腺癌組織中GATA3的mRNA表達(dá)水平。GATA3在前列腺癌組織中的mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織。(2)GATA3過(guò)表達(dá)增強(qiáng)紫杉醇對(duì)DU145細(xì)胞和PC-3細(xì)胞的化療效果。細(xì)胞活力顯著降低,細(xì)胞凋亡顯著增加。轉(zhuǎn)染siRNA以抑制GATA3表達(dá),前列腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇處理的敏感性顯著降低。(3)Western blot檢測(cè),單用桑色素增加前列腺癌細(xì)胞內(nèi)GATA3的表達(dá)水平,與紫杉醇聯(lián)用時(shí)GATA3的表達(dá)水平進(jìn)一步增加。在miR-155過(guò)表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞中,桑色素對(duì)GATA3表達(dá)水平的增強(qiáng)明顯被抑制。(4)裸鼠腫瘤行Western blot檢測(cè),桑色素可顯著增強(qiáng)GATA3表達(dá),與紫杉醇聯(lián)用組腫瘤中GATA3表達(dá)水平最高。4.7免疫組化檢測(cè)顯示桑色素聯(lián)合紫杉醇作用于前列腺癌能抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡桑色素與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)降低前列腺癌細(xì)胞Ki67表達(dá),增高cleaved caspase-3的表達(dá),從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。GATA3在4組腫瘤中無(wú)陽(yáng)性染色。綜上,桑色素抑制前列腺癌細(xì)胞中miR-155的表達(dá),進(jìn)一步增強(qiáng)GATA3表達(dá)。GATA3過(guò)表達(dá)能顯著增強(qiáng)紫杉醇對(duì)DU145和PC-3細(xì)胞的化療效果。因此,桑色素與紫杉醇聯(lián)用處理前列腺癌細(xì)胞時(shí),桑色素通過(guò)抑制miR-155表達(dá)上調(diào)GATA3表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞的化療作用。5.結(jié)論桑色素和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用在體外實(shí)驗(yàn)中處理前列腺癌細(xì)胞DU145和PC-3顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,桑色素與紫杉醇聯(lián)用使腫瘤的生長(zhǎng)速度顯著減緩。桑色素增強(qiáng)紫杉醇在體內(nèi)的抗腫瘤作用。桑色素顯著抑制前列腺癌細(xì)胞中miR-155的表達(dá),上調(diào)GATA3的表達(dá)。GATA3是miR-155調(diào)控的靶基因。桑色素增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌化療效果的作用是通過(guò)抑制miR-155進(jìn)而上調(diào)GATA3表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

逑５．附圖逡逑圖１逡逑Ａ邐ＤＵ１４５邐Ｂ邐ＰＣ－３逡逑１００邐—邐１００邐ｒ１１］逡逑１邋ｋｌＬ邋Ｓ邋ｔ0Ｕ＿逡逑桑色素邋0ｉＭ）邋０．０邋０．０邋ｌ0邋２０邋５０邐桑色索（＿）邋0．0邋０．０邋ｌ0邋２０邋５０逡逑栜薛（ｎＭｉ邋0．0邋ｓｏ邋５０邋５０邋５０邐＾Ｓ（ｎＭ）邋0．0邋５０邋５０邋５０邋５０逡逑圖１示ＤＵ１４５細(xì)胞和ＰＣ－３細(xì)胞在５０邋ｎＭ紫杉醇聯(lián)合各濃度桑色素處理４８小時(shí)逡逑后，檢測(cè)細(xì)胞活力。逡逑（Ａ）邐ＤＵ１４５細(xì)胞活力檢測(cè)。以桑色素濃度為０處理組細(xì)胞活力值作為基數(shù)，逡逑其余各組細(xì)胞的活力值以占基數(shù)的比值（％）的方式比對(duì)。桑色素５０叫組效果逡逑最顯著。＊＊Ｐ〈０．邋０１，表示與空白對(duì)照組有顯著差異。逡逑（Ｂ）邐ＰＣ－３細(xì)胞活力檢測(cè)。以桑色素濃度為０處理組細(xì)胞活力值作為基數(shù)，逡逑其余各組細(xì)胞的活力值以占基數(shù)的比值（％）的方式比對(duì)。桑色素５０叫組效果逡逑最顯著。＊＊Ｐ＜０．邋０１，表示與空白對(duì)照組有顯著差異。逡逑３４逡逑

逡逑圖２逡逑Ａ邐邐ＤＵ１４５邐逡逑，，紫杉＊邋＋U可

本文編號(hào)：2709680