【摘要】：目的:見血封喉苷H(ToxH)是一種新型強心苷,我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)多種強心苷類化合物能引起腫瘤細胞損傷并通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡。另外,還有研究發(fā)現(xiàn),強心苷能通過多種信號通路誘導腫瘤細胞自噬。線粒體自噬(Mitophagy)是一種保護線粒體損傷的機制,我們前期研究發(fā)現(xiàn)強心苷可導致線粒體膜電位降低并通過線粒體途徑促使腫瘤細胞凋亡。為此,我們推測ToxH有可能通過線粒體自噬來保護損傷的細胞。因此,本課題利用分子生物學和細胞生物學等研究手段,進一步了解ToxH是否能夠誘導A549和H460兩種肺癌細胞線粒體自噬,并研究其分子機理。方法:用不同劑量的ToxH處理A549和H460兩種肺癌細胞,并在不同的時間進行觀察和檢測,通過顯微鏡直接觀察細胞形態(tài),利用MTT實驗、EDU實驗檢測ToxH對肺癌細胞的生長和增殖的情況;通過JC-1染色,顯微鏡直接觀察結(jié)果并結(jié)合流式細胞術分析線粒體的膜電位變化;用Western Blotting方法檢測凋亡、線粒體自噬(包括自噬流)和信號通路相關的蛋白分子表達情況;同時用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬標志分子(LC3、P62等)和線粒體自噬標志(Mito-Red)共聚現(xiàn)象,以了解是否產(chǎn)生線粒體自噬;通過RNA干擾(siRNA)或應用自噬阻斷劑干擾相應的分子并綜合以上方法分析ToxH誘導線粒體自噬與相關分子和自噬的關系;通過免疫共沉淀并結(jié)合Western Blotting實驗分析線粒體自噬與其相關分子之間的關系。結(jié)果:1、通過顯微鏡直接觀察發(fā)現(xiàn),鏡下ToxH處理的細胞數(shù)量隨著劑量增大逐漸變少,細胞間連接消失,細胞逐漸脫落,胞體形狀改變,死亡增多。MTT和EDU檢測結(jié)果表明,ToxH對肺癌細胞的生長和增殖有明顯的抑制作用。2、JC-1染色后在熒光顯微鏡下直接觀察,發(fā)現(xiàn)沒有ToxH處理的細胞呈明顯的紅色改變,但隨著ToxH劑量增加,細胞中綠色部分明顯增加;用流式細胞術定量分析膜電位有相同的變化;這些結(jié)果說明隨著ToxH劑量增加,線粒體膜電位發(fā)生改變和線粒體損傷增多。用Western Blotting檢測凋亡相關的表達分子,發(fā)現(xiàn)經(jīng)ToxH處理的肺癌細胞線粒體中的細胞色素C(Cyt c)的表達隨著ToxH處理時間的延長而越來越低,而胞質(zhì)中的Cyt c的表達則相應增高;同時裂解的PARP、Caspase-3和Caspase-9的表達也相應增高,但Caspase-8則沒有改變,說明ToxH通過損傷線粒體途徑誘導肺癌細胞凋亡。3、用Western blotting檢測線粒體膜蛋白表達發(fā)現(xiàn),ToxH處理的細胞中Tom20、Tim23、Hsp60等分子的表達明顯下調(diào);用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞中LC3斑點的數(shù)量明顯增多,并且這些LC3斑點和Mito-Red標記的線粒體以及P62分子均有明顯的共定位現(xiàn)象;用Western blotting檢測胞質(zhì)和線粒體中的自噬標志分子,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞的線粒體中含有更多的P62、LC3-II和Parkin,說明ToxH在肺癌細胞中通過Parkin通路誘導線粒體自噬。4、為了更進一步了解ToxH誘導肺癌細胞產(chǎn)生線粒體自噬的分子機理,通過Western blotting檢測Sirt3和Tom20的表達,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞中Sirt3表達明顯增高,但Tom20表達明顯減少;用RNA干擾Sirt3(siSirt3)表達后Tom20表達恢復正常;同樣在siSirt3并ToxH處理的肺癌細胞中,LC3斑點也沒有發(fā)現(xiàn)和Mito-Red有明顯的共聚現(xiàn)象,另外用RNA干擾Parkin(siParkin)或者用自噬阻斷劑抑制線粒體自噬后,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的肺癌細胞的線粒體中也沒有檢測到明顯的P62、LC3-II和Parkin,這些結(jié)果說明ToxH通過誘導Sirt3高表達促使肺癌細胞產(chǎn)生線粒體自噬。5、為了明確ToxH誘導肺癌細胞高表達Sirt3的分子機理,我們用Western blotting檢測Sirt3、己糖激酶II(hexokinase II,Hex II)、Parkin和電壓依賴性陰離子通道蛋白1(VDAC1)之間的關系,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞中Sirt3表達增高,總Hex II濃度和對照組未處理細胞之間表達差異并沒有明顯變化;實驗分別檢測胞質(zhì)和線粒體中的Hex II,發(fā)現(xiàn)ToxH處理后,胞質(zhì)中的Hex II明顯增高,這種現(xiàn)象在siStirt3的細胞中則沒有出現(xiàn),說明ToxH并不能促使Hex II重合成表達,而是促使主要分布在線粒體中的Hex II向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。用免疫共沉淀的方法檢測在過表達Parkin的肺癌細胞中VDAC1、Parkin和Hex II相互作用,發(fā)現(xiàn)控制組(siCtrl)中,ToxH處理的細胞中有明顯的Parkin和VDAC1共沉淀,沒有明顯的Hex II和VDAC1共沉淀,ToxH未處理的細胞(UT組)中Hex II和VDAC1共沉淀明顯,結(jié)果與ToxH組相反。干擾Sirt3表達后,(siSirt3-ToxH)組中Parkin和DVAC1共沉淀消失而Hex II和VDAC1發(fā)生共沉淀,UT組結(jié)果沒明顯變化。綜合以上結(jié)果,說明ToxH誘導肺癌細胞線粒體自噬是通過高表達Sirt3來下調(diào)Hex II與VDAC1結(jié)合并促使VDAC1和Parkin結(jié)合,進而激活線粒體自噬的Parkin通路。6、我們用干擾Sirt3和自噬阻斷劑3-MA抑制或阻斷ToxH誘導的自噬,然后重復用上述的方法檢測細胞的生長、增殖和凋亡情況,發(fā)現(xiàn)干擾或阻斷線粒體自噬后,ToxH抑制肺癌細胞生長增殖更加明顯,通過線粒體途徑凋亡的細胞明顯增加,說明ToxH誘導的線粒體自噬是一種保護性自噬。結(jié)論:實驗結(jié)果表明:1、ToxH抑制肺癌細胞生長和增殖;2、ToxH通過線粒體途徑誘導肺癌細胞凋亡并能促使肺癌細胞產(chǎn)生線粒體自噬;3、ToxH誘導產(chǎn)生線粒體自噬是通過上調(diào)Sirt3表達并下調(diào)Hex II與VDAC1結(jié)合,進而促使VDAC1和Parkin結(jié)合,這可能是激活線粒體自噬經(jīng)典Parkin通路的一種機制;4、ToxH誘導的線粒體自噬是一種保護性的自噬,聯(lián)合線粒體自噬抑制劑或新型自噬阻斷技術有可能是增強ToxH抗腫瘤類藥物療效的重要策略。
【圖文】：

劑配制S液：取8 g NaCL，0.2 g KCL，2.88 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g K離子水充分溶解，然后定容至1 L，4 °C保存?zhèn)溆�。多聚甲醛固定液：�?0 g 甲醛溶液溶解在800 ml去離子水中，并均勻攪拌，小心滴入1 N NaOH 溶液5~10滴，靜置待液體完液 PH 值到7.4~7.6之間，加入0.02 M 的 D-hanks 1 L，最后用2 L，充分混勻，小心過濾兩次，4 °C保存。％聚丙烯酰胺溶液：將290 g丙烯酰胺（Acr）和10 g亞甲雙小心加去離子水充分攪拌混勻，然后定容至1 L，4 °C避光保存泳緩沖液：小心將14.4 g 甘氨酸溶液，3 g Tris堿，1 g SDS, 去圖 1.見血封喉苷 H（ToxH）的化學結(jié)構Figure 1. The chemical structure of toxicarioside H (ToxH)

化學藥物抗腫瘤作用最主要的特性就是能夠抑制腫瘤細胞生長和增殖，，為此我們先通過觀察細胞形態(tài)，然后利用 MTT 和 EDU 兩種體外實驗檢測 ToxH是否具有抑制 A549 和 H460 兩種肺癌細胞生長和增殖的作用。首先，將不同濃度（0.2、0.4、0.6 μM 三個劑量）的 ToxH 分別培養(yǎng) A549和 H460 肺癌細胞，對照組用 ToxH 溶劑 DMSO（培養(yǎng)方式和劑量與藥物培養(yǎng)細胞相同，等同于 ToxH（0 μM）作為陰性對照，用阿霉素（Doxorubicin，Dox，0.6 或 0.8 μM 兩個劑量）作為陽性對照。圖 2 是 ToxH 處理 24 小時后 A549和 H460 兩種細胞通過倒置顯微鏡觀察到的細胞形態(tài)，可見對照組（DMSO）的肺癌細胞在鏡下貼壁生長，細胞清晰，相鄰細胞融合緊密，隨著 ToxH 用藥劑量的增加，ToxH 處理的實驗組鏡下細胞單位面積數(shù)量逐漸變少，細胞間連接消失，細胞逐漸脫落，胞體形狀改變，死亡增多，說明 ToxH 對 A549 和 H460細胞具有細胞毒作用，這種細胞毒作用隨著 ToxH 藥物濃度的增加而增高。
【學位授予單位】：海南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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本文編號：2709410