發(fā)布時間：2020-06-12 07:37

【摘要】：單寧酸(Tannic acid)是一類水溶性多酚,廣泛存在于石榴、五倍子、葡萄和芒果等植物中。由于單寧酸具有很強的抗氧化、抗炎、降糖降脂和抗癌活性而倍受關(guān)注。然而,目前單寧酸抑制腫瘤的分子機制以及發(fā)揮抗腫瘤作用的靶點尚不清楚。本研究利用單寧酸功能化磁性納米顆粒來鑒定單寧酸在結(jié)腸癌細胞中的靶蛋白,同時深入研究單寧酸如何通過該靶蛋白發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細胞增殖的功效,并探討單寧酸與靶蛋白發(fā)生相互作用的位點和作用方式。我們從以下三個方面開展研究工作:1.利用Fe_3O_4磁性納米顆粒的特異性吸附功能,以磁性納米顆粒作為載體,在乙醇中把單寧酸修飾在Fe_3O_4磁性納米顆粒上,然后利用透射電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜儀進行分析確認。然后利用solid-phase實驗,采用pull down垂釣出單寧酸在結(jié)腸癌細胞中的特異性結(jié)合蛋白,通過SDS-PAGE電泳和銀染法確定差異蛋白,質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)單寧酸與M2型丙酮酸激酶(Pyruvate kinase M2,PKM2)特異性結(jié)合。2.通過MTT法和細胞克隆形成實驗,發(fā)現(xiàn)單寧酸顯著抑制結(jié)腸癌細胞DLD1和HCT-116的細胞增殖,而對人正常上皮細胞FHC的細胞增殖無影響。實驗探討了PKM2的哪種激酶活性在單寧酸抑制結(jié)腸癌細胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組GST-PKM2蛋白可促使Akt蛋白磷酸化水平升高,加入單寧酸并不能使得由重組GST-PKM2引起的Akt磷酸化水平降低。這表明單寧酸抑制的結(jié)腸癌細胞增殖并不依賴于PKM2的蛋白激酶活性。進一步過表達PKM1來研究丙酮酸激酶活性在單寧酸抑制結(jié)腸癌細胞增殖中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與瞬時轉(zhuǎn)染GFP的對照組相比,瞬時轉(zhuǎn)染GFP-PKM1能夠逆轉(zhuǎn)單寧酸對結(jié)腸癌細胞活性的抑制作用。這表明單寧酸抑制結(jié)腸癌細胞增殖依賴于PKM2的丙酮酸激酶活性。酶活力實驗結(jié)果顯示,單寧酸能夠明顯抑制PKM2的丙酮酸激酶活性,而對PKM1的酶活性抑制效果不明顯。綜上所述,單寧酸特異抑制PKM2的丙酮酸激酶活性。3.熒光光譜結(jié)果顯示,單寧酸與PKM2之間存在相互作用。酶動力學(xué)結(jié)果顯示,單寧酸與PKM2的抑制類型屬于非競爭性抑制。Pull down結(jié)果顯示,Fe_3O_4磁性納米顆粒能夠與His-PKM2蛋白發(fā)生相互作用,而與His-PKM1無相互作用。化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)結(jié)果顯示,單寧酸處理使得PKM2的四聚體含量減少。由于果糖1,6-二磷酸(Fructose 1,6-bisphosphate,FBP)能別構(gòu)調(diào)節(jié)PKM2,促使PKM2四聚體的形成,因此我們研究了單寧酸抑制PKM2的活性是否與別構(gòu)調(diào)節(jié)相關(guān)。結(jié)果顯示,單寧酸抑制PKM2的活性并不能被FBP所逆轉(zhuǎn)。這表明單寧酸可能占據(jù)了FBP與PKM2的結(jié)合位點。由于FBP別構(gòu)調(diào)節(jié)PKM2的結(jié)合位點上有六個重要的氨基酸位點,而且已知影響PKM2丙酮酸激酶活性的只有第399位精氨酸(R399)和第433位亮氨酸(K433)。我們采用pull down實驗,發(fā)現(xiàn)單寧酸能夠結(jié)合His-R399E蛋白,而與His-K433E蛋白沒有相互作用。采用MTT和酶學(xué)實驗探討單寧酸抑制PKM2丙酮酸激酶活性和結(jié)腸癌細胞增殖是否依賴其與PKM2的K433位點結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單寧酸能夠明顯抑制DLD1-GFP細胞的增殖以及PKM2酶活性,而單寧酸對DLD1-K433E的細胞增殖以及PKM2酶活性的抑制效果不明顯。這些結(jié)果說明,單寧酸通過結(jié)合于PKM2的K433位點,導(dǎo)致PKM2代謝活性降低進而抑制結(jié)腸癌細胞增殖。以上結(jié)果表明,單寧酸通過與PKM2上K433結(jié)合,特異性抑制PKM2的丙酮酸激酶活性,來實現(xiàn)對結(jié)腸癌細胞增殖的抑制。
【圖文】：

圖 1.1 丙酮酸激酶的四種同工酶[42]Fig. 1.1 Four isoforms of pyruvate kinase2 在腫瘤細胞中的表達及其相關(guān)調(diào)控機制生長的細胞要高速消耗營養(yǎng)物質(zhì)，必須維持 ATP 合成以及包括蛋

4圖 1.2 調(diào)控 PKM2 二聚體與四聚體轉(zhuǎn)變的細胞信號[42]Fig. 1.2 Cellular signals that modulate PKM2 enzymatic activity.tofk 等在 Nature 上的報道揭示，用 PKM1 取代腫瘤細胞中的 PK
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.35

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 朱s，

本文編號：2709213