【摘要】：背景及目的:ALL是淋巴細(xì)胞系前體細(xì)胞的克隆性增殖性疾病。盡管應(yīng)用目前的治療手段,B-ALL緩解率逐漸提高,但患者耐藥及復(fù)發(fā)后的二次緩解比例較低,整體預(yù)后不良�？笴D19 CAR T細(xì)胞治療B-ALL可以靶向殺傷白血病細(xì)胞,提高難治復(fù)發(fā)患者的緩解率,并為造血干細(xì)胞移植爭取機會。但由于白血病細(xì)胞免疫逃逸、骨髓中微小殘存病灶的存在及腫瘤微環(huán)境中的保護機制,使患者不能達到長期緩解。同時抗CD19 CAR T細(xì)胞治療臨床試驗的患者會出現(xiàn)一系列治療相關(guān)的不良反應(yīng),嚴(yán)重的不良反應(yīng)將威脅患者生命。目前尚缺乏模擬B-ALL患者接受同源CAR T細(xì)胞治療的動物模型。另外,增強T細(xì)胞清除殘存白血病病灶的治療方法尚需進一步探索。本研究以人源化小鼠為基礎(chǔ),通過建立MLL-AF9融合基因誘導(dǎo)的人B-ALL人源化小鼠模型為受者,應(yīng)用同基因人源化小鼠T細(xì)胞制備的抗CD19 CAR T細(xì)胞進行治療。建立模擬臨床患者的患病及CAR T細(xì)胞治療過程的小鼠模型。白血病小鼠模型中的人B-ALL細(xì)胞表達CXCR4,其與白血病細(xì)胞的歸巢、治療抵抗及疾病復(fù)發(fā)相關(guān),通過阻斷基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1,SDF-1/CXCL12)/CXCR4通路,探索增強T細(xì)胞免疫殺傷B-ALL細(xì)胞的方法。方法:在實驗一,構(gòu)建人B-ALL人源化小鼠模型,應(yīng)用同基因抗CD19 CAR T細(xì)胞進行治療。1.建立MLL-AF9誘導(dǎo)的人B-ALL人源化小鼠模型。分離人源化小鼠T細(xì)胞,制備抗CD19 CAR T細(xì)胞。應(yīng)用抗CD19 CAR T細(xì)胞治療B-ALL人源化小鼠模型。2.流式分析儀對小鼠模型的白血病細(xì)胞、抗CD19 CAR T細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞進行分析,檢測抗CD19 CAR T細(xì)胞在小鼠體內(nèi)增殖及存活情況、白血病細(xì)胞增殖及被殺傷情況。3.監(jiān)測小鼠血清細(xì)胞因子及生存情況,觀察小鼠CAR T細(xì)胞治療后細(xì)胞因子釋放與抗白血病效應(yīng)的相關(guān)性及CAR T細(xì)胞治療效果。在實驗二,以人B-ALL NSG小鼠為模型,應(yīng)用異基因T細(xì)胞殺傷白血病細(xì)胞。探索能否應(yīng)用CXCR4拮抗劑阻斷SDF-1/CXCR4通路,使白血病細(xì)胞進入外周,從而增強T細(xì)胞殺傷白血病細(xì)胞效果。1.建立B-ALL NSG小鼠模型,應(yīng)用異基因T細(xì)胞在體內(nèi)殺傷白血病細(xì)胞。2.注射CXCR4拮抗劑AMD3100。3.檢測小鼠外周血各種細(xì)胞的比例及數(shù)量,觀察白血病細(xì)胞被殺傷情況及異基因移植后移植物抗宿主反應(yīng)。4.監(jiān)測小鼠生存期、檢測小鼠組織器官中白血病細(xì)胞數(shù)量及比例,觀察殘存白血病細(xì)胞被清除的情況。5.過繼移植治療后小鼠骨髓細(xì)胞到NSG小鼠體內(nèi),監(jiān)測疾病長期緩解情況。結(jié)果:實驗一:1.通過人類胚胎胸腺及胚胎肝臟CD34+細(xì)胞移植建立人源化小鼠模型。在移植后第7周人源化小鼠人類細(xì)胞嵌合率達49%以上。構(gòu)建人B-ALL人源化小鼠模型。2.CAR T細(xì)胞制備及體外擴增。分離人源化小鼠脾臟中T細(xì)胞,制備抗CD19 CAR T細(xì)胞及對照組CAR T細(xì)胞,并在體外擴增。轉(zhuǎn)染率分別為73%和45.3%。3.B-ALL人源化小鼠接受CAR T細(xì)胞輸注治療,發(fā)揮抗CD19陽性細(xì)胞作用。CAR T細(xì)胞輸注后第1、2和第4周,抗CD19 CAR T細(xì)胞治療組小鼠B淋巴細(xì)胞明顯少于對照CAR T細(xì)胞治療組,P值分別為0.0144,0.0047和0.0059。第6和第8周,抗CD19 CAR T細(xì)胞治療組小鼠白血病細(xì)胞明顯少于對照CAR T細(xì)胞治療組,P值分別為0.0001和0.0048。4.B-ALL人源化小鼠抗CD19 CAR T細(xì)胞治療后血清中細(xì)胞因子釋放。治療后第1周抗CD19 CAR T治療組小鼠血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)及白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)顯著性高于對照CAR T治療組,P值分別為0.0095和0.0422;治療后第4周抗CD19 CAR T治療組小鼠血清中γ干擾素(interferon-γ,INF-γ)顯著性高于對照CAR T治療組,P值為0.0161。5.抗CD19 CAR T細(xì)胞治療延長B-ALL人源化小鼠生存時間。對照CAR T細(xì)胞治療組小鼠生存時間為51~82天(中位生存時間為72天),抗CD19 CAR T治療組小鼠生存時間為CAR T細(xì)胞治療后86~120天(中位生存時間為99天),生存期明顯長于對照CAR T治療組小鼠,P值為0.003。實驗二:1.小鼠骨髓中白血病細(xì)胞較外周組織抵抗T細(xì)胞治療。白血病NSG小鼠接受異基因T細(xì)胞治療,小鼠骨髓中的白血病細(xì)胞比例明顯高于外周血、脾臟、肝臟、肺及腎臟(P0.001)。2.B-ALL NSG小鼠白血病細(xì)胞表達CXCR4。3.CXCR4拮抗劑使ALL NSG小鼠白血病細(xì)胞進入外周血。給予B-ALL NSG小鼠注射AMD3100(以下簡稱AMD)或PBS。第一次及最后一次給藥后3、6和12 h AMD組小鼠外周血白血病細(xì)胞的比例和細(xì)胞計數(shù)明顯高于PBS組。第1次給藥后第7天AMD組小鼠外周血細(xì)胞比例及計數(shù)均顯著性低于PBS組,P值分別為0.0359和0.001,而第21天及28天兩組小鼠外周血白血病細(xì)胞無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組小鼠組織器官中白血病細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。4.CXCR4拮抗劑協(xié)助供體淋巴細(xì)胞輸注(donor lymphocyte injection,DLI)增強移植物抗白血病(graft-versus-leukemia,GVL)效應(yīng)。DLI聯(lián)合AMD治療組在第15天,外周血白血病細(xì)胞水平明顯低于DLI聯(lián)合PBS對照組,P值為0.0001。DLI后第25天,DLI聯(lián)合AMD組小鼠骨髓白血病細(xì)胞的比例明顯低于DLI聯(lián)合PBS組,P值為0.0075。5.CXCR4拮抗劑聯(lián)合DLI在更具侵襲性的B-ALL NSG模型中也可以達到清除白血病作用。在白血病細(xì)胞增殖較快的B-ALL NSG小鼠模型中,給予兩輪DLI聯(lián)合AMD/PBS治療。首次治療后第31天AMD組小鼠(2/5小鼠未檢測到GFP+細(xì)胞)外周血白血病百分比和計數(shù)明顯低于PBS組,P值分別為0.0098和0.007;AMD組小鼠骨髓中白血病細(xì)胞計數(shù)明顯低于PBS組,P值為0.0174。DLI聯(lián)合AMD/PBS小鼠骨髓作為1代小鼠,骨髓細(xì)胞移植給2代NSG小鼠。AMD組2代小鼠外周血白血病細(xì)胞明顯低于PBS組2代小鼠,第5、6、7及第8周P值分別為0.033、0.0077、0.0133和0.0829。AMD組1只2代小鼠23周均未檢測出白血病細(xì)胞。結(jié)論:1.用人源化小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞構(gòu)建的CD19 CAR T細(xì)胞可以在體外擴增。2.用人源化小鼠脾臟T細(xì)胞構(gòu)建的CD19 CAR T細(xì)胞可在B-ALL人源化小鼠體內(nèi)殺傷普通的人B淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞。3.應(yīng)用CD19 CAR T細(xì)胞治療的B-ALL人源化小鼠血清中細(xì)胞因子升高。4.CD19 CAR T細(xì)胞存活和擴增程度與治療效果呈正相關(guān)。5.CD19 CAR T細(xì)胞治療B-ALL人源化小鼠模型能夠模擬臨床情況,為CAR T細(xì)胞抗腫瘤作用評價及改善治療方法提供良好的模型。6.B-ALL對骨髓中異基因T細(xì)胞的殺傷作用不如在外周敏感。7.CXCR4拮抗劑AMD3100可以使骨髓中白血病細(xì)胞進入外周。8.在B-ALL NSG小鼠模型中,單純應(yīng)用AMD3100不能有效清除白血病細(xì)胞。9.應(yīng)用AMD3100不增加DLI的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)效應(yīng)。10.CXCR4拮抗劑增強異基因T細(xì)胞抗白血病效應(yīng)。
【圖文】：

圖1.1 CAR T 細(xì)胞抗原受體及其基因序列的演變Figure 1.1 CAR T cell antigen receptor and its gene sequence evolution（A）第1代到第4代CAR T細(xì)胞抗原受體的結(jié)構(gòu)改變。scFv ：單鏈可變區(qū)；VH（heavy chainvariable area）：重鏈可變區(qū)；VL（light chain variable area）：輕鏈可變區(qū)；Co-stimulatorymolecule：共刺激分子；HPSE（Heparanase）：肝素酶。（改編自Maude, S. L. CD19-targetedchimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. 2015, Blood[45]）（B）第1代到第4代CAR T細(xì)胞抗原受體基因序列演變。TM（trans membrane domain）：跨膜區(qū)；LTR（long terminal repeat）：長末端重復(fù)序列；IRES（indicates internal ribosome entry site）：內(nèi)部核糖體進入點，能夠使蛋白質(zhì)翻譯起始不依賴于5‘帽結(jié)構(gòu)，核糖體可以直接進入并對其之后的序列進行翻譯，從而使直接從信使RNA（mRNA）中間起始翻譯成為可能；其之后的序列呈持續(xù)表達，，而不依賴于胞外段scFv被目標(biāo)抗原的活化后向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的活化信號。（改編自Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need forprior conditioning. 2012, Blood.[46]）

9圖1.2 CRS發(fā)生機制[70]Figure 1.2 The mechanism of CRS generation目前已有的報道對CRS發(fā)生機制進行了探討。CRS可由靶細(xì)胞的裂解和T細(xì)胞的活化所釋放的細(xì)胞因子所激發(fā)，這些細(xì)胞因子包括IFN-γ和TNF-α等。接著這些細(xì)胞因子又進一步鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，激活了巨噬細(xì)胞、DC、細(xì)胞毒T細(xì)胞等，被活化的細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8等。Ang-2：血管生成素2，DC：樹突狀細(xì)胞，MHC-I：主要組織相容性復(fù)合體I，NK cell：自然殺傷細(xì)胞，TCR：T細(xì)胞受體，vWF：血管性血友病因子。（本圖來自于Shimabukuro-Vornhagen, A.等人的文章，Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer. 2018）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.71

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王巖石;田志剛;;免疫系統(tǒng)人源化小鼠的構(gòu)建及其應(yīng)用進展[J];中國免疫學(xué)雜志;2016年03期

2 王臣;溫文彥;張春杰;;鼠源單克隆抗體人源化研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年11期

3 任曉楠;周曉輝;;用于肝臟疾病研究的人源化小鼠模型概述[J];中國實驗動物學(xué)報;2014年05期

4 李曉燕;胡正;趙同標(biāo);;人源化小鼠在人造血免疫系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[J];發(fā)育醫(yī)學(xué)電子雜志;2014年03期

5 陳煒;馮娟;施海霞;梁虹;張連峰;;人源化小鼠人源細(xì)胞檢測方法[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2010年07期

6 張秋玉;盛慧明;崔磊;王瑛;尹爍;林錦驃;吳娟娟;沈佰華;王利;李寧麗;;利用人源化小鼠研究組織工程材料的體內(nèi)免疫原性[J];組織工程與重建外科雜志;2009年04期

7 焦靜;劉躍;;治療用單抗的人源化和優(yōu)化[J];藥學(xué)進展;2017年09期

8 連晶瑤;丁苗慧;秦國慧;張毅;王純耀;;免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的研究進展[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2017年10期

9 喬卿華;韓佩君;汪愛勤;尹文;;用于病毒研究的人源化小鼠研究進展[J];生物技術(shù)通訊;2014年01期

10 范文紅;畢華;饒春明;王軍志;;重組人源化兔抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體生物學(xué)活性檢測方法的建立[J];中國生物制品學(xué)雜志;2012年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 黃一虹;劉蒼春;谷紅紅;李德鵬;李振宇;徐開林;;人源化慢性粒細(xì)胞白血病小鼠模型的初步建立[A];第四屆全國血液腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第七屆全國淋巴腫瘤診治進展研討會論文匯編[C];2014年

2 李亮平;;TCR-HLA人源化小鼠的研制和應(yīng)用[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會2013年全國學(xué)術(shù)大會·武漢論文摘要集[C];2013年

3 趙邑;趙峰梅;齊延紅;潘薇薇;何永吉;張全愛;;人源化抗組織因子TF抗體的構(gòu)建和表達[A];2008年全國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會論文摘要[C];2008年

4 歐陽清;閆博;趙晶;楊安鋼;;單鏈抗體e23sFv的人源化抗體制備及其在HER2靶向腫瘤殺傷中的功能鑒定[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會壁報交流集[C];2017年

5 荊寶琴;張金曉;段蕊;申秀萍;;重組人源化抗VEGF單克隆抗體注射液全身主動過敏性試驗[A];2015年（第五屆）藥物毒理學(xué)年會論文集[C];2015年

6 王晶晶;裴天仙;郭景s

本文編號：2708720