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急性B淋巴細胞白血病人源化小鼠的T淋巴細胞免疫治療研究

發(fā)布時間:2020-06-12 00:30
【摘要】:背景及目的:ALL是淋巴細胞系前體細胞的克隆性增殖性疾病。盡管應用目前的治療手段,B-ALL緩解率逐漸提高,但患者耐藥及復發(fā)后的二次緩解比例較低,整體預后不良?笴D19 CAR T細胞治療B-ALL可以靶向殺傷白血病細胞,提高難治復發(fā)患者的緩解率,并為造血干細胞移植爭取機會。但由于白血病細胞免疫逃逸、骨髓中微小殘存病灶的存在及腫瘤微環(huán)境中的保護機制,使患者不能達到長期緩解。同時抗CD19 CAR T細胞治療臨床試驗的患者會出現(xiàn)一系列治療相關的不良反應,嚴重的不良反應將威脅患者生命。目前尚缺乏模擬B-ALL患者接受同源CAR T細胞治療的動物模型。另外,增強T細胞清除殘存白血病病灶的治療方法尚需進一步探索。本研究以人源化小鼠為基礎,通過建立MLL-AF9融合基因誘導的人B-ALL人源化小鼠模型為受者,應用同基因人源化小鼠T細胞制備的抗CD19 CAR T細胞進行治療。建立模擬臨床患者的患病及CAR T細胞治療過程的小鼠模型。白血病小鼠模型中的人B-ALL細胞表達CXCR4,其與白血病細胞的歸巢、治療抵抗及疾病復發(fā)相關,通過阻斷基質細胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1,SDF-1/CXCL12)/CXCR4通路,探索增強T細胞免疫殺傷B-ALL細胞的方法。方法:在實驗一,構建人B-ALL人源化小鼠模型,應用同基因抗CD19 CAR T細胞進行治療。1.建立MLL-AF9誘導的人B-ALL人源化小鼠模型。分離人源化小鼠T細胞,制備抗CD19 CAR T細胞。應用抗CD19 CAR T細胞治療B-ALL人源化小鼠模型。2.流式分析儀對小鼠模型的白血病細胞、抗CD19 CAR T細胞及其他免疫細胞進行分析,檢測抗CD19 CAR T細胞在小鼠體內(nèi)增殖及存活情況、白血病細胞增殖及被殺傷情況。3.監(jiān)測小鼠血清細胞因子及生存情況,觀察小鼠CAR T細胞治療后細胞因子釋放與抗白血病效應的相關性及CAR T細胞治療效果。在實驗二,以人B-ALL NSG小鼠為模型,應用異基因T細胞殺傷白血病細胞。探索能否應用CXCR4拮抗劑阻斷SDF-1/CXCR4通路,使白血病細胞進入外周,從而增強T細胞殺傷白血病細胞效果。1.建立B-ALL NSG小鼠模型,應用異基因T細胞在體內(nèi)殺傷白血病細胞。2.注射CXCR4拮抗劑AMD3100。3.檢測小鼠外周血各種細胞的比例及數(shù)量,觀察白血病細胞被殺傷情況及異基因移植后移植物抗宿主反應。4.監(jiān)測小鼠生存期、檢測小鼠組織器官中白血病細胞數(shù)量及比例,觀察殘存白血病細胞被清除的情況。5.過繼移植治療后小鼠骨髓細胞到NSG小鼠體內(nèi),監(jiān)測疾病長期緩解情況。結果:實驗一:1.通過人類胚胎胸腺及胚胎肝臟CD34+細胞移植建立人源化小鼠模型。在移植后第7周人源化小鼠人類細胞嵌合率達49%以上。構建人B-ALL人源化小鼠模型。2.CAR T細胞制備及體外擴增。分離人源化小鼠脾臟中T細胞,制備抗CD19 CAR T細胞及對照組CAR T細胞,并在體外擴增。轉染率分別為73%和45.3%。3.B-ALL人源化小鼠接受CAR T細胞輸注治療,發(fā)揮抗CD19陽性細胞作用。CAR T細胞輸注后第1、2和第4周,抗CD19 CAR T細胞治療組小鼠B淋巴細胞明顯少于對照CAR T細胞治療組,P值分別為0.0144,0.0047和0.0059。第6和第8周,抗CD19 CAR T細胞治療組小鼠白血病細胞明顯少于對照CAR T細胞治療組,P值分別為0.0001和0.0048。4.B-ALL人源化小鼠抗CD19 CAR T細胞治療后血清中細胞因子釋放。治療后第1周抗CD19 CAR T治療組小鼠血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)及白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)顯著性高于對照CAR T治療組,P值分別為0.0095和0.0422;治療后第4周抗CD19 CAR T治療組小鼠血清中γ干擾素(interferon-γ,INF-γ)顯著性高于對照CAR T治療組,P值為0.0161。5.抗CD19 CAR T細胞治療延長B-ALL人源化小鼠生存時間。對照CAR T細胞治療組小鼠生存時間為51~82天(中位生存時間為72天),抗CD19 CAR T治療組小鼠生存時間為CAR T細胞治療后86~120天(中位生存時間為99天),生存期明顯長于對照CAR T治療組小鼠,P值為0.003。實驗二:1.小鼠骨髓中白血病細胞較外周組織抵抗T細胞治療。白血病NSG小鼠接受異基因T細胞治療,小鼠骨髓中的白血病細胞比例明顯高于外周血、脾臟、肝臟、肺及腎臟(P0.001)。2.B-ALL NSG小鼠白血病細胞表達CXCR4。3.CXCR4拮抗劑使ALL NSG小鼠白血病細胞進入外周血。給予B-ALL NSG小鼠注射AMD3100(以下簡稱AMD)或PBS。第一次及最后一次給藥后3、6和12 h AMD組小鼠外周血白血病細胞的比例和細胞計數(shù)明顯高于PBS組。第1次給藥后第7天AMD組小鼠外周血細胞比例及計數(shù)均顯著性低于PBS組,P值分別為0.0359和0.001,而第21天及28天兩組小鼠外周血白血病細胞無統(tǒng)計學意義。兩組小鼠組織器官中白血病細胞數(shù)無統(tǒng)計學意義。4.CXCR4拮抗劑協(xié)助供體淋巴細胞輸注(donor lymphocyte injection,DLI)增強移植物抗白血病(graft-versus-leukemia,GVL)效應。DLI聯(lián)合AMD治療組在第15天,外周血白血病細胞水平明顯低于DLI聯(lián)合PBS對照組,P值為0.0001。DLI后第25天,DLI聯(lián)合AMD組小鼠骨髓白血病細胞的比例明顯低于DLI聯(lián)合PBS組,P值為0.0075。5.CXCR4拮抗劑聯(lián)合DLI在更具侵襲性的B-ALL NSG模型中也可以達到清除白血病作用。在白血病細胞增殖較快的B-ALL NSG小鼠模型中,給予兩輪DLI聯(lián)合AMD/PBS治療。首次治療后第31天AMD組小鼠(2/5小鼠未檢測到GFP+細胞)外周血白血病百分比和計數(shù)明顯低于PBS組,P值分別為0.0098和0.007;AMD組小鼠骨髓中白血病細胞計數(shù)明顯低于PBS組,P值為0.0174。DLI聯(lián)合AMD/PBS小鼠骨髓作為1代小鼠,骨髓細胞移植給2代NSG小鼠。AMD組2代小鼠外周血白血病細胞明顯低于PBS組2代小鼠,第5、6、7及第8周P值分別為0.033、0.0077、0.0133和0.0829。AMD組1只2代小鼠23周均未檢測出白血病細胞。結論:1.用人源化小鼠脾臟T淋巴細胞構建的CD19 CAR T細胞可以在體外擴增。2.用人源化小鼠脾臟T細胞構建的CD19 CAR T細胞可在B-ALL人源化小鼠體內(nèi)殺傷普通的人B淋巴細胞及白血病細胞。3.應用CD19 CAR T細胞治療的B-ALL人源化小鼠血清中細胞因子升高。4.CD19 CAR T細胞存活和擴增程度與治療效果呈正相關。5.CD19 CAR T細胞治療B-ALL人源化小鼠模型能夠模擬臨床情況,為CAR T細胞抗腫瘤作用評價及改善治療方法提供良好的模型。6.B-ALL對骨髓中異基因T細胞的殺傷作用不如在外周敏感。7.CXCR4拮抗劑AMD3100可以使骨髓中白血病細胞進入外周。8.在B-ALL NSG小鼠模型中,單純應用AMD3100不能有效清除白血病細胞。9.應用AMD3100不增加DLI的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)效應。10.CXCR4拮抗劑增強異基因T細胞抗白血病效應。
【圖文】:

序列,細胞抗原,受體,基因序列


圖1.1 CAR T 細胞抗原受體及其基因序列的演變Figure 1.1 CAR T cell antigen receptor and its gene sequence evolution(A)第1代到第4代CAR T細胞抗原受體的結構改變。scFv :單鏈可變區(qū);VH(heavy chainvariable area):重鏈可變區(qū);VL(light chain variable area):輕鏈可變區(qū);Co-stimulatorymolecule:共刺激分子;HPSE(Heparanase):肝素酶。(改編自Maude, S. L. CD19-targetedchimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. 2015, Blood[45])(B)第1代到第4代CAR T細胞抗原受體基因序列演變。TM(trans membrane domain):跨膜區(qū);LTR(long terminal repeat):長末端重復序列;IRES(indicates internal ribosome entry site):內(nèi)部核糖體進入點,能夠使蛋白質翻譯起始不依賴于5‘帽結構,核糖體可以直接進入并對其之后的序列進行翻譯,從而使直接從信使RNA(mRNA)中間起始翻譯成為可能;其之后的序列呈持續(xù)表達,,而不依賴于胞外段scFv被目標抗原的活化后向細胞內(nèi)傳導的活化信號。(改編自Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need forprior conditioning. 2012, Blood.[46])

細胞因子,血管性血友病因子,主要組織相容性復合體,自然殺傷細胞


9圖1.2 CRS發(fā)生機制[70]Figure 1.2 The mechanism of CRS generation目前已有的報道對CRS發(fā)生機制進行了探討。CRS可由靶細胞的裂解和T細胞的活化所釋放的細胞因子所激發(fā),這些細胞因子包括IFN-γ和TNF-α等。接著這些細胞因子又進一步鏈式反應,激活了巨噬細胞、DC、細胞毒T細胞等,被活化的細胞釋放更多的細胞因子,如IL-6、IL-8等。Ang-2:血管生成素2,DC:樹突狀細胞,MHC-I:主要組織相容性復合體I,NK cell:自然殺傷細胞,TCR:T細胞受體,vWF:血管性血友病因子。(本圖來自于Shimabukuro-Vornhagen, A.等人的文章,Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer. 2018)
【學位授予單位】:吉林大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2018
【分類號】:R733.71

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本文編號:2708720


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