【摘要】：【目的】通過慢病毒(載有特定靶向于人ARID1A基因的shRNA)轉(zhuǎn)染AGS和SGC7901胃癌細(xì)胞,構(gòu)建沉默ARID1A基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株模型。探討沉默ARID1A基因?qū)ι掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程的影響以及是否促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲,通過蛋白水平初步探討沉默ARID1A影響EMT過程的可能分子機制�！痉椒ā�1.通過實時熒光相對定量PCR(RT-qPCR)及蛋白免疫印跡(Western blot)檢測胃癌細(xì)胞中ARID1A基因mRNA及蛋白水平表達(dá)情況。2.構(gòu)建慢病毒(載有特定靶向于人ARID1A基因的shRNA)載體,轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株AGS、SGC7901,并用嘌呤霉素進(jìn)行篩選。經(jīng)RT-qPCR和Western blot法從mRNA及蛋白水平驗證ARID1A基因敲減效果,獲得沉默ARID1A基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株。3.運用倒置顯微鏡觀察敲減ARID1A基因前后胃癌細(xì)胞形態(tài)的變化;敲減ARID1A基因?qū)ξ赴┘?xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程的影響:Western blot檢測上皮標(biāo)志物E-鈣黏素(E-cadherin),間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏素(N-cadherin)、Vimentin。4.通過CCK8及Transwell實驗檢測沉默ARID1A基因后,胃癌細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞侵襲能力等生物學(xué)行為的變化。5.沉默ARID1A引起EMT相關(guān)信號通路PI3K/Akt蛋白的變化:Western blot檢測PI3K、Akt、p-Akt(S473)�！窘Y(jié)果】1.ARID1A基因在胃癌細(xì)胞株中均有表達(dá),選擇ARID1A相對高表達(dá)的胃癌細(xì)胞AGS及SGC7901進(jìn)行后續(xù)實驗。2.構(gòu)建ARID1A-shRNA重組載體的慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株,并成功篩選出穩(wěn)定沉默ARID1A的胃癌細(xì)胞株。RT-qPCR結(jié)果顯示:AGS、SGC7901細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后,與陰性空載體對照組相比,基因沉默組ARID1A mRNA水平表達(dá)明顯下調(diào)(P0.01)。Western blot結(jié)果顯示:與陰性空載體對照組相比,基因沉默組ARID1A蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.01、P0.001)。3.沉默ARID1A基因后細(xì)胞形態(tài)由緊密的上皮形態(tài)變?yōu)槭杷傻拈g質(zhì)形態(tài),進(jìn)而提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程的相關(guān)蛋白變化,觀察到上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降,間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin上升,提示敲減ARID1A基因誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。4.CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示:AGS、SGC7901細(xì)胞種板后早期(12h內(nèi)),ARID1A基因沉默組與陰性空載體組相比,細(xì)胞增殖活性在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異(P0.05);但在種板的24h、48h、72h,與陰性空載體組相比,ARID1A基因沉默組增殖活性增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001、P0.0001)。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,與陰性空載體組相比,基因沉默組更多胃癌細(xì)胞穿過基質(zhì)膠,細(xì)胞侵襲能力明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義((P0.001、P0.0001)。本結(jié)果提示我們:下調(diào)ARID1A基因可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。5.Western blot結(jié)果顯示:與陰性空載體組相比,穩(wěn)定沉默ARID1A的SGC7901細(xì)胞中,ARID1A表達(dá)水平顯著降低,同時發(fā)現(xiàn)PI3K表達(dá)上調(diào),總Akt蛋白表達(dá)無差異,但是Akt的磷酸化(pAKT-Ser473)水平升高。提示沉默ARID1A可能通過上調(diào)PI3K蛋白表達(dá)進(jìn)而影響下游Akt磷酸化,激活PI3K/Akt通路�！窘Y(jié)論】1.敲減ARID1A促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。2.沉默ARID1A可能通過上調(diào)PI3K蛋白表達(dá),影響下游Akt磷酸化,激活PI3K/Akt通路,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。
【圖文】：

福建醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果3.1 胃癌細(xì)胞株 ARID1A mRNA 轉(zhuǎn)錄水平收集對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞 MGC-803、AGS、SGC7901、MKN45、BGC823，提取 RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,RT-qPCR 儀檢測 ARID1A mRNA 水平的表達(dá)情況。實時熒光定量 PCR 檢測結(jié)果顯示(圖 1)：ARID1A 在 5 種胃癌細(xì)胞株的 mRNA 水平均有表達(dá)，其中在 AGS、SGC7901 及 MGC-803 細(xì)胞中表達(dá)相對較高。

圖 2 A：5 種胃癌細(xì)胞 ARID1A 蛋白表達(dá)情況 B:ARID1A/GAPDH 的相對灰度值（*、**分別表示與 MKN45 細(xì)胞相比，另外 4 種胃癌細(xì)胞 ARID1A 蛋白水平 P<0.05、P＜0.01）3.3 篩選穩(wěn)定沉默 ARID1A 表達(dá)的胃癌細(xì)胞株3.3.1 RT-qPCR 法驗證 ARID1A 基因慢病毒 shRNA 干擾效果胃癌細(xì)胞 AGS、SGC7901 種板 12h 貼壁后換液，加入慢病毒轉(zhuǎn)染，培養(yǎng) 24h后換液，，用終濃度為 4μg/ul 的嘌呤霉素（puromycin）進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)染 5 天后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總 RNA，用 RT-qPCR 法檢測 AGS、SGC7901 胃癌細(xì)胞株 mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果顯示（如圖 3）：AGS、SGC7901 細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，與陰性空載體對照組相比(NC)，基因沉默組（KD）ARID1A mRNA 水平表達(dá)明顯下調(diào)。通過 GraphPad Prism 6 圖像分析軟件及 SPSS 統(tǒng)計分析，沉默組與對照組細(xì)胞株間差異有統(tǒng)計學(xué)上的意義(P<0.01)，達(dá)到實驗篩選要求。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2707637