發(fā)布時間：2020-06-11 01:08

【摘要】：1研究背景肺癌嚴重危害人類生命健康,目前為我國惡性腫瘤死因的第一位,且其發(fā)病率仍在不斷提高。原發(fā)性中央型氣道非小細胞肺癌是指原發(fā)于氣管、主支氣管和右中間段支氣管的非小細胞性惡性上皮性腫瘤,與其他部位肺癌相比,該類腫瘤在病理組織學特征、臨床特點、中醫(yī)證候分布等方面尚不明確,從而給本疾病的中醫(yī)、西醫(yī)治療治療造成困難。前期的預實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),中央型氣道非小細胞肺癌中,涎腺型癌占很高的比例,這不僅給西醫(yī)的病理診斷造成極大困難,同時也為涎腺型癌的中醫(yī)證候研究帶來了新課題。因此,有必要對本組腫瘤進行系統(tǒng)的病理學分析、組織學鑒別診斷、中醫(yī)證候分析、化療及預后指標研究等,以期全面地了解其西醫(yī)分類和中醫(yī)證候的特點及內(nèi)在聯(lián)系,為更有針對性地進行中西醫(yī)治療提供理論基礎(chǔ)。本課題獲得北京中醫(yī)藥大學中青年教師課題資助。2研究目的通過對一組中央型氣道非小細胞肺癌進行經(jīng)典病理學、中醫(yī)辨證分型、免疫組織化學及分子病理學研究,達到以下目的：①闡明中央型氣道非小細胞肺癌的臨床病理特點,為西醫(yī)治療方案的選擇提供指導；②系統(tǒng)研究和探討中央型氣道非小細胞肺癌中醫(yī)證候的分布情況,確立其與病理組織學、臨床特征、腫瘤TNM分期等的相關(guān)性,為今后更好地指導中央型氣道非小細胞肺癌的中西醫(yī)結(jié)合治療提供參考依據(jù)；③找到一個簡單、高效及最優(yōu)化的抗體組合,用以鑒別中央氣道型肺癌的不同組織學類型,包括鱗癌、腺癌、腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌、肌上皮癌、涎腺腺癌(非特指)等；④探討ERCC1、Beta-tubulin這兩種與化療藥物選擇、估計預后相關(guān)指標在中央型氣道非小細胞肺癌中的表達,以及與不同中醫(yī)證候的關(guān)系；⑤通過研究中央型氣道非小細胞肺癌不同組織學類型中ALK基因異常情況,探討克唑替尼等靶向藥物用于本組病人治療的可能性。3研究對象研究對象為病理學診斷證實的肺原發(fā)性非小細胞肺癌,臨床分期為Ⅲ期及Ⅳ期的患者,病變部位為中央型氣道；病例來源為2013年6月至2014年5月間北京煤炭總醫(yī)院腫瘤微創(chuàng)治療中心收治的支氣管鏡介入性治療的肺癌患者,治療時收集其切除的腫瘤標本,并收集其臨床資料；共收集符合入組標準的109例病人的標本,其中男性91例,女性18例,年齡最小29歲,最大者86歲,中位年齡62歲。4研究內(nèi)容及方法4.1研究內(nèi)容①中央型氣道非小細胞肺癌的病理組織學類型及臨床特點；②中央氣道型非小細胞肺癌的中醫(yī)證候分布特征,以及與病理組織學、TNM分期等的關(guān)系；③優(yōu)化免疫組化抗體組合,以鑒別不同組織學類型的中央型氣道非小細胞肺癌；④ERCC1、Beta-tubulin在中央型氣道非小細胞肺癌中的表達規(guī)律,以及與中醫(yī)證候的關(guān)系;⑤ALK基因的異常改變情況。4.2研究方法4.2.1中醫(yī)證候判定及臨床數(shù)據(jù)采集中醫(yī)證候標準根據(jù)2002版《中藥新藥臨床研究指導原則》。TNM分期根據(jù)2009年AJCC第7版非小細胞肺癌分期標準。通過查閱文獻,設(shè)計詳細的CRF表,從病人的病歷記錄中提取基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料,對所有的病人進行床旁深度訪談問診及體格檢查,以確定病人的中醫(yī)證候；所有入組的病人均有病理組織學診斷證實,凡不符合要求者隨后剔除,不納入本研究。4.2.2組織處理及病理學診斷肺癌的組織學診斷標準根據(jù)2004WHO肺癌腫瘤分類以及2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌分類標準。標本經(jīng)中性緩沖福爾馬林固定8-72小時,自動脫水機脫水,常規(guī)石蠟包埋;制備厚度4微米連續(xù)切片,用于HE染色及免疫組化染色；使用全自動組織芯片儀制作組織芯片,用于免疫組化染色。所有切片均由2名高級職稱病理醫(yī)師分別雙盲組織學觀察、免疫組化觀察及評分。對于診斷有分歧的病例則在多頭鏡下,共同協(xié)商確定組織學診斷及免疫組化評判。4.2.3免疫組化染色及判斷標準4.2.3.1 ALK-D5F3ALK-D5F3工作液,使用Ventana全自動免疫組化染色機染色。陽性者為腫瘤細胞中存在強的顆粒狀胞漿染色,排除已知的染色因素,包括肺泡巨噬細胞胞漿中較淡的點彩狀染色、神經(jīng)纖維及神經(jīng)節(jié)細胞、浸潤的淋巴細胞、壞死物及粘液等；ALK-D5F3陰性對照：腫瘤細胞內(nèi)不存在強的顆粒狀胞漿染色。4.2.3.2 p63p63原液,1：200稀釋度,使用Ventana全目動免疫組化機染色。P63陽性染色定義為明確的核著色,p63表達陽性標準為陽性細胞數(shù)目≥10%全部腫瘤細胞數(shù)。同時觀察p63陽性細胞分布特點,分為兩種：彌漫性及癌巢周邊部“鑲邊狀”分布。4.2.3.3 p40p40鼠單抗原液,1：200稀釋度,使用Ventana全自動免疫組化機染色。p40染色與p63相同,為核陽性著色,p40表達陽性病例判斷標準為陽性細胞數(shù)≥10%者。記錄陽性細胞分布特點,分為兩種：彌漫性及癌巢周邊部分布。4.2.3.4 TTF-1TTF-1鼠單抗原液,1：200稀釋度,使用Ventana全自動免疫組化機染色。TTF-1為核陽性著色。陽性細胞數(shù)≥10%者判斷為陽性,其余的為陰性。4.2.3.5 Ki-67Ki-67克隆號MIB-1抗體原液,1：200稀釋度,使用Ventana全自動免疫組化機染色。Ki-67為核陽性著色,計算方法為Ki-67指數(shù),即核陽性細胞占所有腫瘤細胞的百分數(shù)。4.2.3.6 SMASMA單抗原液1：100稀釋度,使用前述手工免疫組化染色流程,陽性著色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)較強的棕黃色著色。對于陽性者,同時觀察其細胞分布特點,包括彌漫性分布或在腫瘤細胞巢周圍環(huán)繞狀分布。4.2.3.7 ERCC1ERCC1鼠單抗原液,稀釋度1：300,使用前述手工免疫組化染色流程,陽性著色為核陽性著色。ERCC1核表達分為四級：無任何陽性細胞或10%陽性,得分為0;10%核隱隱／幾乎難以察覺的部分腫瘤細胞表達者,得分1+；10%腫瘤細胞核呈中等強度染色得分2+;10%腫瘤細胞核呈強陽性染色,得分3+。本研究采用兩級標準：2+或3+分為陽性,0分或1+為陰性。4.2.3.8 Beta-tubulinBeta-tubulin鼠單抗原液,稀釋度1：100,使用前述手工免疫組化染色流程,陽性著色為胞漿棕黃色著色。Beta-tubulin表達評分為為4級,胞漿無著色者為0分：較弱的剛剛能觀察到的10%的腫瘤細胞胞漿著色為1+；10%腫瘤細胞弱到中等強度著色為2+；10%腫瘤細胞強胞漿著色為3+；本研究采用兩級分類標準,0和1+為陰性,2+及3+為陽性。4.2.4 ALK-FISH商用的ALK基因的斷裂-分離雙色探針按照制造商的說明進行染色。該5'ALK探針標記SpectrumGreen,3'ALK探針標記SpectrumOrange。染色在組織芯片的石蠟切片上進行。用熒光顯微鏡在100X油鏡下,每例觀察至少100個非重疊的細胞內(nèi)的雜交信號。ALK-FISH陽性的標準為100個分析細胞中,大于等于15個細胞顯示ALK基因的熒光探針的側(cè)面分離,紅綠信號分離的距離超過2個信號直徑。如果陽性細胞數(shù)介于5-15之間,則需另外計數(shù)100個細胞,若大于等于15個陽性細胞,仍可視為ALK FISH陽性。4.2.5統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件,計數(shù)資料使用非參數(shù)的卡方檢驗,計量資料使用t檢驗,方差不齊時使用秩和檢驗。5研究結(jié)果5.1中央型氣道非小細胞肺癌的病理及臨床特點5.1.1病理組織學類型的構(gòu)成,鱗癌69例,占63.3%,涎腺型癌27例,占24.8%,腺癌10例,占9.2%,其他的腺鱗癌2例、癌肉瘤1例。涎腺型癌中,腺樣囊性癌最多見,占55.6%,肌上皮癌占22.2%,涎腺腺癌(非特指)占14.8%,其中肌上皮癌有涎腺腺癌(非特指)為罕見的原發(fā)于肺的涎腺型癌。5.1.2臨床病理特點：老年、男性、吸煙病人以鱗癌為主；年輕、女性、不吸煙病人以涎腺型癌為主。5.2中央型氣道非小細胞肺癌的中醫(yī)證候及分布特點5.2.1本組共109例肺癌中,氣虛痰濕證36例,陰虛熱毒證12例,氣陰兩虛證40例,氣血瘀滯證21例；從其分布特點來看,鱗癌及涎腺型癌患者中,以氣陰兩虛證為最多見,分別占41.4%及40.7%；腺癌中以氣虛痰濕證為最多見,占50%。5.2.2中醫(yī)證候與年齡、性別、吸煙史及卡氏評分等均相關(guān),老年病人、男性、有吸煙史、卡氏評分高于60分者,均以氣陰兩虛證為主；而年輕病人、女性、無吸煙史、卡氏評分低于60分者,多以氣虛痰濕證候為主。5.3免疫組化鑒別診斷及與中醫(yī)證候的關(guān)系5.3.1 p63不同中醫(yī)證候間p63陽性表達率有極顯著性差異(P0.01),其中在氣陰兩虛證候中陽性率為97.5%,而在陰虛熱毒證病人中陽性率較低,約66.7%。p63在不同病理組織學類型癌中表達有極顯著性差異(P0.01),其中在鱗癌中的表達率100%,腺癌中無一例陽性表達,涎腺型癌中陽性率約81.5%。p63在鱗癌、肌上皮癌中呈彌漫性／彌散性表達,但在腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌中,呈癌巢周圍“鑲邊狀”分布。彌漫性p63陽性對于診斷鱗癌的敏感性為100%,特異性為82.5%;p63"鑲邊狀”陽性對于腺樣囊性癌和粘液表皮樣癌診斷的特異性及敏感性均為100%。5.3.2 p40不同中醫(yī)證候間p40陽性表達率有極顯著性差異(P0.01),其中氣陰兩虛證陽性率高(97.5%),而陰虛熱毒證病人陽性率較低(58.3%)。p40在不同病理組織學類型癌中表達有極顯著性差異(P0.01),其中在鱗癌中的表達率100%,腺癌中無一例陽性表達,涎腺型癌中陽性率約77.8%。p40在鱗癌、肌上皮癌中呈彌漫性／彌散性表達,但在腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌中,呈癌巢周圍“鑲邊狀”分布。彌漫性p40陽性對于診斷鱗癌的敏感性為100%,特異性為90.0%; p40“鑲邊狀”陽性對于腺樣囊性癌和粘液表皮樣癌診斷的特異性及敏感性均為100%。5.3.3 TTF-1TTF-1在鱗癌無一例表達,腺癌陽性率為50%,涎腺型癌有2例個別細胞陽性,但10%,未達到陽性標準；TTF-1對腺癌診斷的敏感性為50%,特異性為100%。5.3.4 SMASMA在鱗癌及腺癌中無一例表達。在肌上皮癌中,呈彌漫性陽性表達(100%),在腺樣囊性癌中,為癌巢周圍“鑲邊狀”陽性表達,陽性率93.3%�！拌傔厾�"SMA陽性對腺樣囊性癌+粘液表皮樣癌診斷的敏感性為94.1%,特異性為100%。5.3.5 Ki-67Ki-67指數(shù)在涎腺型癌與非涎腺型癌兩組之間比較有極顯著性差異,涎腺型癌的Ki-67指數(shù)平均數(shù)顯著低于非涎腺型癌者。5.3.6 ERCC1與Beta-tubulinERCC1陽性率在不同中醫(yī)證候病例間有極顯著性差異(P0.01),在氣虛痰濕證及氣血瘀滯證中陽性率較高,而在陰虛熱毒證中表達較低。Beta-tubulin陽性率在不同病理組織學類型間有極顯著性差異(P0.01),在腺癌中陽性率較高,而在涎腺型癌中表達較低。5.4 ALK免疫組化及ALK-FISH通過免疫組化和FISH的方法,共檢測出3例ALK陽性肺癌,其中腺癌2例,占20%,鱗癌1例,占1.45%。6結(jié)論6.1明確了中央型氣道非小細胞肺癌的中醫(yī)證候分布及臨床特征：男性、吸煙、鱗癌病人多為氣陰兩虛證,女性、不吸煙、涎腺型癌／腺癌病人,多為氣虛痰濕證或陰虛熱毒證。6.2 ERCC1在氣虛痰濕證及氣血瘀滯證中陽性率高,在陰虛熱毒證中表達較低；Beta-tubulin在腺癌中表達最高,其次是鱗癌,在涎腺型癌中表達最低。ERCC1及Beta-tubulin的表達檢測可為選擇化療藥物、判斷病人預后有參考價值。6.3闡明了中央型氣道非小細胞肺癌有其獨特的臨床病理特點,包括：①主要由鱗癌、涎腺型癌、腺癌3種組織學類型；②涎腺型癌占很高的比例；③有肌上皮癌、涎腺腺癌(非特指)等少見類型；④老年、男性、吸煙病人以鱗癌為主;年輕、女性、不吸煙病人以涎腺型癌為主。6.4證實了p40/TTF-1/SMA三種抗體作為高效的組合,可以鑒別中央型氣道非小細胞肺癌的組織類型：①鱗癌：p40彌漫性／彌散性(+),TTF-1(-),SMA(-);②腺癌：p40陰性,TTF-1(+)或(-),SMA(-)；③腺樣囊性癌／粘液表皮樣癌：p40及SMA癌巢周“鑲邊狀”(+),TTF-1(-),個別散在弱(+)；④肌上皮癌：SMA(+),p40部分彌散性(+),TTF-1(-)；⑤涎腺腺癌,非特指：p40陰性,SMA陰性,TTF-1(-)；⑥p40對鱗癌診斷的特異性高于p63;⑦涎腺型癌的Ki-67指數(shù)低于鱗癌及腺癌。6.5 中央型氣道腺癌、鱗癌均有ALK基因重排,適合選擇分子靶向藥物治療。涎腺型癌中未發(fā)現(xiàn)有ALK的基因重排異常。7創(chuàng)新點7.1首次以中央型氣道非小細胞肺癌為研究對象,闡明了不同不醫(yī)證候各自的組織學特點及臨床特征,從而為更有針對性地中西醫(yī)治療提供理論基礎(chǔ)；7.2找到了一個最佳抗體組合,用以鑒別診斷中央型氣道非小細胞肺癌的各種組織學類型,并研究了ERCC1, Beta-tubulin, ALK等治療靶標在不同類型癌中的表達特點及最優(yōu)的化療藥物選擇方案。
【圖文】：

圖２肺淲癌、肺腺癌中的主要信號通路及其功能逡逑引自視她，ＢＡ，Ｈｕｇｈｅｓ，邋ＢＧ邋Ｔｒａｎｓｌ邋Ｌｕｎｇ邋Ｃａｎｃｅｒ邋２０１５，，４（１）３６－５因子受體（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ邋ｇｒｏｗ化邋ｆａｄｏｒ邋ｗｅｅｐ化ｒ，ＥＧＦＲ）逡逑的分布與功能逡逑

發(fā)現(xiàn)有已知的驅(qū)動基因突變，見圖ｉＰ４１。涉及的主要信號通路包括逡逑ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫｓ邋ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－邋ｍＴＯ民或邋ＪＡＫ－ＳＴＡＴ邋通路等，見逡逑圖２。通過使用小分子抑制物或受體的單克隆抗體，從而抑制上調(diào)的信號通路，逡逑繼而獲得很好的X1向治療效果。其中目前使用最廣的分別是針對ＥＧＦＲ和ＡＬＫ信逡逑號通路的祀向治療。逡逑４０逡逑
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：2707147