發(fā)布時間：2020-06-11 00:38

【摘要】：研究目的探討長鏈非編碼RNA XIST(lncRNA-XIST)在胃癌組織及血漿中表達水平與臨床意義。原代培養(yǎng)人胃粘膜成纖維細胞(Human gastric mucosa fibroblast,HGMF),并在缺氧條件下刺激其活化。在此基礎上驗證長鏈非編碼RNA-XIST基因(Long non-coding RNA,lncRNA-XIST)是否與胃癌相關成纖維細胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化相關。并尋找可能與RNA-XIST促GCAF活化相關的差異表達基因與信號通路(Pathway)。研究方法收集40例胃癌患者手術切除的胃癌組織及癌旁組織標本,抽取90例胃癌患者術前血漿樣本和90例健康體檢者血漿樣本。利用實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR)檢測上述標本中l(wèi)ncRNA-XIST的表達水平。進行統(tǒng)計學分析并判斷l(xiāng)ncRNA-XIST表達水平與胃癌患者臨床病理參數(年齡、性別、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度、Ki-67陽性率)的關系。通過繪制受試者工作特征(ROC)曲線,評價血漿lncRNA-XIST在診斷胃癌時的效能。收集胃癌患者術中切除的正常胃粘膜組織,用組織塊培養(yǎng)法對胃粘膜成纖維細胞進行原代培養(yǎng)。成功培養(yǎng)后,光學顯微鏡下鑒定其形態(tài)特征,同時用免疫熒光染色鑒定確認細胞來源及純度;將HGMF與胃癌細胞(SGC-7901和MGC-803)共培養(yǎng),通過間隙性缺氧處理構建GCAF的體外活化模型。建模成功后,用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中α-SMA、FAP的表達情況,利用CCK-8試驗、Transwell遷移試驗及流式細胞技術分別檢測細胞增殖、遷移及抗凋亡能力,驗證是否建模成功;利用qPCR檢測GCAF活化前后的lncRNA-XIST基因表達變化情況,驗證lncRNA-XIST與GCAF的活化是否存在相關性。利用siRNA干擾GCAF中的lncRNA-XIST基因表達,用ELISA法檢測相關活化因子表達水平。利用CCK-8法、Transwell侵襲試驗及流式細胞技術分別檢測siRNA轉染后GCAF的增殖、侵襲及抗凋亡能力,證實lncRNA-XIST與GCAF活化明確相關;用轉錄組測序技術(RNA Sequencing,RNA-seq)檢測和分析出siRNA轉染GCAF后的差異基因和相關通路,探尋LncRNA-XIST參與GCAF活化的具體機制。研究結果胃癌組織中l(wèi)ncRNA-XIST表達較癌旁組織升高,胃癌組血漿lncRNA-XIST表達高于健康體檢組;差異均有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。胃癌組織及血漿中的lncRNA-XIST表達水平與胃癌TNM分期、淋巴結轉移、分化程度相關(P均0.05)。培養(yǎng)出的細胞貼壁生長,大小一致,呈長條形或梭狀,排列方向大體一致,符合成纖維細胞形態(tài)特點。免疫熒光鑒定結果顯示細胞結蛋白(Desmin)表達陰性,而波形絲蛋白(Vimentin)表達陽性,符合HGMF的蛋白特征,證明原代培養(yǎng)成功。建立GCAF活化模型后,細胞培養(yǎng)液中CXCL12、IL-6、TGF-β1及HGF表達水平均明顯高于對照組(HGMF),差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。GCAF中α-SMA、FAP相關mRNA較對照組表達明顯上調(P0.05);GCAF活化后的細胞增殖、遷徙、抗凋亡能力較HGMF明顯增強(P0.05);GCAF的lncRNA-XIST表達量較HGMF顯著上調(P0.05)。慢病毒轉染后,培養(yǎng)液中前述活化效應分子表達水平均低于空白組和陰性對照組(P0.05),且細胞的增殖、遷移及抗凋亡能力下降(P0.05);干擾lncRNA-XIST表達后,H19、PTP4A1、EIF3E、KLF5、ALB、CYP24A1等基因差異表達,主要參與組織細胞組成和生物合成的調節(jié)、有絲分裂細胞周期等生物過程;參與的細胞組織有囊泡、細胞骨架、膜組織等,參與粘附斑激酶信號通路、FcγR介導巨噬細胞吞噬作用等信號通路。研究結論lncRNA-XIST在胃癌組織及血漿中表達升高,并可以促進GCAF的活化過程;下調LncRNA-XIST表達可以抑制GCAF的增殖與遷移能力,并促進其凋亡,提示LncRNA-XIST有可能成為胃癌新的腫瘤標志物和治療靶點。
【圖文】：

所有數據均應用 SPSS 21.0 軟件進行分析。所有資料均用 Shapira-Wilkinson 法檢其正態(tài)性。若計量資料符合正態(tài)分布，用（x s）表示，兩組比較用 t 檢驗，多組較用方差分析；若不符合正態(tài)分布，則用 M（Q1，Q3）表示，組間比較采用非參檢驗。通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線判斷漿中 lncRNA-XIST 表達水平在胃癌診斷中的靈敏度和特異度。所有統(tǒng)計檢驗均為側檢驗，P<0.05 表示差別有統(tǒng)計學意義。三、實驗結果1、胃癌組織及血漿中l(wèi)ncRNA-XIST的表達水平 根據qRT-PCR數據計算出的2-△ Ct值表lncRNA-XIST與內參基因表達水平的相對倍數關系，2-△ Ct值越大表示lncRNA-XIST表達水平高。結果顯示，胃癌組織lncRNA-XIST的2-△ Ct值為0.150(0.094,0.247)，高于癌旁組織[0.0850.041,0.193）]，，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012，圖1.1A）。胃癌患者術前靜脈血漿lncRNA-XIST2-△ Ct值為0.189（0.119,0.256），與健康體檢者[0.144(0.095,0.180)]相比差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01，圖1.1B）。

長鏈非編碼 RNA-XIST 與胃癌相關成纖維細胞活化的相關性研究測時，均高于 CEA、CA199、CA724 單獨及聯合檢測時的檢測效力（圖 1.2，表 1.3）。漿 lncRNA-XIST 診斷 TNMⅠ~Ⅱ期胃癌時 AUC 為 0.694(95%CI 0.592～0.796，P0.01)，靈敏度為 38.5%，特異度為 95.6%，也均優(yōu)于 CEA、CA199、CA724 單獨及合檢測（圖 1.3、表 1.3）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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1 陳在昌;張浩;申曉軍;畢建威;;胃癌相關成纖維細胞條件培養(yǎng)基對胃癌細胞增殖和侵襲的影響[J];上海醫(yī)學;2011年07期

本文編號：2707110