【摘要】：[研究背景]乳腺癌是嚴(yán)重影響女性健康最常見的惡性腫瘤之一。近年來,中國女性乳腺癌發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢,已高居女性惡性腫瘤的第一位。盡管隨著乳腺癌病因和發(fā)病機制研究、治療方式及治療方案的改進,乳腺癌死亡率明顯降低,但是其早期診斷、療效和預(yù)后并不樂觀,腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和抵抗治療仍然是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌的病因及發(fā)病機制復(fù)雜,其發(fā)生是一個多因素誘導(dǎo)、多基因參與和多路徑相互作用的復(fù)雜過程。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與機體的免疫系統(tǒng)密切相關(guān),一方面機體通過免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視和免疫清除功能識別、殺傷并清除腫瘤細(xì)胞;另一方面腫瘤細(xì)胞可以修飾自身抗原或者異常表達一些負(fù)性調(diào)控分子,改變機體腫瘤微環(huán)境并負(fù)性調(diào)控機體的抗腫瘤免疫,使腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫識別與攻擊,從而逃避免疫監(jiān)視而發(fā)生免疫逃逸。腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是影響腫瘤患者預(yù)后的首要因素,轉(zhuǎn)移過程是極其復(fù)雜的動態(tài)過程,包括癌細(xì)胞本身特性、機體免疫、內(nèi)分泌、代謝與微環(huán)境等多方面因素之間相互作用。此外,機體本身的基因與遺傳因素也與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān),乳腺癌相關(guān)遺傳因素涉及多個基因,這些基因的單核苷酸多態(tài)性及其特定組合可能是造成癌癥易感性最重要的原因。Tim-3作為抗腫瘤免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,是近年來腫瘤免疫研究的熱點,通過其機制的研究以及與其特異性結(jié)合并抑制其表達的分子或者單克隆抗體的研制,對實現(xiàn)腫瘤免疫治療有著重要的研究價值和巨大的潛力。Tim-3廣泛表達于Th1細(xì)胞、細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞,可在人體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌和免疫細(xì)胞的功能來調(diào)節(jié)機體的防御功能,在一系列炎癥疾病和腫瘤等多種免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。已有研究證實,Tim-3并不局限于在各種免疫細(xì)胞表達,也異位表達在一系列的正常的和惡性的組織中,在促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,并且其表達與患者預(yù)后不良相關(guān)。然而,Tim-3與乳腺癌之間的關(guān)系知之甚少。在本研究中,我們首先探討Tim-3基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌易感性和預(yù)后之間的關(guān)聯(lián),從而篩選與乳腺癌易感性相關(guān)的多態(tài)性位點或者等位基因,為探索乳腺癌易感的遺傳因素提供數(shù)據(jù)支持和揭示乳腺癌發(fā)病機制提供新的依據(jù),還可以為疾病高危人群的早期診斷預(yù)防和干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。其次,我們對乳腺癌患者腫瘤組織及相對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中Tim-3的表達情況與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性進行探討,并進一步通過靶向沉默和過表達Tim-3分子來研究Tim-3對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,識別癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的新型分子機制,為乳腺癌診治提供新策略、新思路。第一部分Tim-3基因多態(tài)性與乳腺癌易感性、臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系研究[研究目的]乳腺癌是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。乳腺癌的遺傳因素涉及多個基因,這些基因的單核苷酸多態(tài)性及其特定組合可能是造成癌癥易感性最重要的原因。國內(nèi)外的研究顯示Tim-3基因的啟動子區(qū)和編碼區(qū)均存在多態(tài)性的變化,這些多態(tài)性可能與多種疾病的易感性相關(guān)。在本研究中,我們將探討在我國北方地區(qū)漢族女性人群中位于Tim-3基因啟動子區(qū)域-rs10053538(GT)-1516位置、啟動子區(qū)域rs10515746(GT)-574 位置以及位于 Tim-3 基因外顯子 rs1036199(TG)+4259位置的單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌易感性之間的關(guān)聯(lián),同時通過比較Tim-3多態(tài)性與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系來探討其和乳腺癌進展和預(yù)后的關(guān)系。[研究方法]我們隨機招募了 301名浸潤性乳腺癌患者和151名健康對照者作為研究對象。采集受試者靜脈血2-3ml,進行基因組DNA樣本的提取。收集樣本進行巢式PCR擴增、測序,測序文件采用Sequencher 5.0軟件與Tim-3基因3個SNP周圍序列進行比對,觀察待測SNP位置核苷酸類型。實驗結(jié)果運用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。運用χ2檢驗或Fisher確切概率法比較觀察到的和預(yù)期的基因型頻率;運用SHEsis軟件進行Hardy-Weinberg平衡分析、單倍體和連鎖不平衡分析。非條件logistic回歸計算優(yōu)勢比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI),估計各種危險因素與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)強度。[研究結(jié)果]1.-1516G/T和-574G/T位點基因型及等位基因頻率在乳腺癌患者和健康對照中的分布沒有差異,這兩個位點SNP與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險沒有相關(guān)性(P0.05)。+4259T/G位點TT、TG基因型在對照組和乳腺癌組分別為98.7%和1.3%,90.7%和9.3%,TG基因型頻率在乳腺癌組明顯高于對照組,顯著增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(OR7.641,95%CI,1.795-32.522,P= 0.001);+4259T/G等位基因G頻率在乳腺癌中明顯升高,均明顯增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(OR7.317,95%CI,1.731-30.925,P= 0.001)。2.-1516G/T和-574G/T位點的基因頻率和乳腺癌患者組織學(xué)分級、腫瘤大小,淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義無顯著差異(P0.05);而+ 4259T/G位點基因多態(tài)性與乳腺癌患者組織學(xué)分級、腫瘤大小無關(guān),而與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移有關(guān),攜帶TG基因型的乳腺癌伴有腫瘤轉(zhuǎn)移的概率分別是攜帶TT基因型女性的3.158倍(OR3.158,95%CI:1.300-7.672,P=0.011)。3.+ 4259TG基因型與ER、PR和HER-2沒有顯著關(guān)聯(lián)(P0.05),而與Ki-67增殖標(biāo)記指數(shù)相關(guān)(OR 2.632,95%CI:1.121-6.179,P=0.022)。[研究結(jié)論]Tim-3基因啟動子區(qū)域的-1516G/T和-574G/T位點SNP與乳腺癌的易感性無關(guān),而外顯子區(qū)域的+4259TG單核苷酸多態(tài)性位點與乳腺癌患者的遺傳易感性有關(guān);并且Tim-3基因+ 4259T/G位點SNP多態(tài)性與腫瘤轉(zhuǎn)移和Ki-67增殖指數(shù)相關(guān),提示Tim-3基因+4259T/G多態(tài)性可作為中國北方漢族女性浸潤性乳腺癌的候選易感基因以及預(yù)測乳腺癌患者進展和預(yù)后的一個重要分子標(biāo)志物。第二部分Tim-3在乳腺癌組織表達及與臨床病理特征和預(yù)后的研究[研究目的]Tim-3作為抗腫瘤免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在腫瘤免疫、器官移植、炎性疾病和自身免疫性疾病等過程中發(fā)揮著重要作用。其促進腫瘤免疫逃逸、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的分子機制引起了很多學(xué)者的關(guān)注,通過其機制的研究以及與其特異性結(jié)合并抑制其表達的分子或者單克隆抗體等免疫檢查點抑制劑的研制,對預(yù)測腫瘤預(yù)后以及實現(xiàn)腫瘤免疫治療有著重要的學(xué)術(shù)價值和社會價值。研究證實,Tim-3表達并不局限于免疫細(xì)胞,也異位表達在一系列正常和惡性組織中,在促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,并且其表達與患者預(yù)后不良相關(guān)。本部分研究中,我們分別檢測乳腺癌患者腫瘤組織及相對應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本中Tim-3 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達情況,并分析其在乳腺癌腫瘤組織中的表達與臨床病理特征及預(yù)后之間的相關(guān)性,探討Tim-3在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后中的作用。[研究方法]我們隨機選擇2011年至2012在山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院收治的42例浸潤性乳腺癌患者。收集常規(guī)手術(shù)乳腺癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋,組織切片用于組織免疫化學(xué)檢測。另外隨機收集2015年手術(shù)切除的新鮮乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本20例,用于實時定量PCR和Western blot檢測。此外,分析乳腺癌腫瘤組織中的Tim-3表達水平與患者臨床病理特征包括年齡、腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、臨床分期以及相對應(yīng)免疫組化指標(biāo)PR、ER、p53、Ki-67指數(shù)及總生存期(OS)的關(guān)聯(lián)。所有實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。[研究結(jié)果]1.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,Tim-3蛋白主要定位于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。42例乳腺癌組織中,Tim-3陽性表達18例,陽性表達率為42.9%。42例相應(yīng)癌旁正常組織中,Tim-3蛋白陽性表達4例,陽性表達率為18.2%,乳腺癌組織中Tim-3蛋白陽性率明顯高于癌旁組織(P0.01)。Tim-3蛋白表達進一步通過半定量免疫反應(yīng)評分比較,乳腺癌組織比癌旁正常組織顯示更高的分?jǐn)?shù)(P0.01)。2.收集新鮮乳腺癌及相應(yīng)癌旁正常組織,進一步提取蛋白,用Western blot法在蛋白水平進行驗證,可見這兩種組織的泳道均有Tim-3蛋白條帶,乳腺癌組織表達相對較癌旁組織強;用qRT-PCR在mRNA水平進行Tim-3檢測,結(jié)果顯示,乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織均有Tim-3 mRNA的表達,且Tim-3 mRNA在乳腺癌組織中的相對表達量明顯高于相應(yīng)癌旁正常組織(P0.001)。3.統(tǒng)計分析Tim-3蛋白表達水平與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果顯示,Tim-3表達水平半定量免疫反應(yīng)評分,與臨床分期(P= 0.0278)、轉(zhuǎn)移(P=0.0207)以及免疫組化Ki-67指數(shù)(P=0.0444)密切相關(guān),而與年齡(P0.05)、組織學(xué)類型(P0.05)、腫瘤大小(P0.05)以及常用免疫組化指標(biāo)PR、ER、p53染色(P0.05)無顯著相關(guān)性。4.Tim-3表達陰性組的乳腺癌患者5年生存率為95.8%,而Tim-3陽性組5年生存率為72.2%,Kaplan-Meier生存分析顯示,Tim-3陽性表達組患者較Tim-3表達陰性組具有更短的生存時間(log-rank χ2=5.171,P=0.023)。[研究結(jié)論]1.Tim-3在人乳腺癌組織中Tim-3蛋白及mRNA水平均異常高表達,提示Tim-3表達可能和乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。2.Tim-3表達水平與乳腺癌的臨床分期、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫組化Ki-67增殖指數(shù)以及生存期密切相關(guān),提示其與腫瘤進展及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。第三部分Tim-3對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用及機制研究[研究目的]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,快速復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和較差的生存率是腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)的增殖、激活的侵襲和轉(zhuǎn)移以及正常細(xì)胞凋亡抑制引起的。腫瘤細(xì)胞的浸襲和轉(zhuǎn)移能力是影響腫瘤患者預(yù)后的首要因素,浸襲和轉(zhuǎn)移過程是極其復(fù)雜的動態(tài)過程,包括癌細(xì)胞本身特性、機體免疫、內(nèi)分泌、代謝與微環(huán)境及等多方面因素之間相互作用。EMT過程在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用,其與高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的乳腺癌之間存在相關(guān)性。研究表明,Tim-3在可以觸發(fā)骨肉瘤腫瘤細(xì)胞獲得具有侵襲性的EMT特征,并可能參與其中惡性腫瘤的發(fā)病機制。我們推斷Tim-3促進乳腺癌的發(fā)展轉(zhuǎn)移可能與EMT相關(guān),在本部分研究中我們通過過表達和靶向沉默Tim-3分子,明確Tim-3對人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,進一步探討Tim-3對乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制。[研究方法]采用Western blot方法分別檢測乳腺癌MDA-MB-231,MCF-7和MCF-7/ADM細(xì)胞中Tim-3蛋白的表達情況。構(gòu)建沉默Tim-3的Tim3-siRNA和Tim-3過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Tim-3,分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞。采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Tim-3mRNA的表達水平,驗證轉(zhuǎn)染效率。采用CCK8實驗、細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測各組細(xì)胞的增殖、遷移能力、侵襲能力和凋亡變化情況。采用Western blot方法檢測Tim-3基因表達變化后對EMT轉(zhuǎn)移相關(guān)分子(MMP-9、TIMP-1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)表達水平的影響。[研究結(jié)果]1.MDA-MB-231,MCF-7和MCF-7/ADM細(xì)胞中均有Tim-3蛋白的表達;轉(zhuǎn)染后各組MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中Tim-3 mRNA水平檢測結(jié)果顯示,在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,與control組相比,siTim-3組Tim-3 mRNA表達量均明顯降低(P0.05),而Tim-3組Tim-3mRNA的表達量均明顯升高(P0.05)。2.細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,與control組相比,各時間點siTim-3組細(xì)胞的增殖活性均明顯降低(P0.05),而Tim-3組各時間點細(xì)胞的增殖活性均明顯增高(P0.05)。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,與control組相比,siTim-3組細(xì)胞的遷移率明顯降低(P0.05),而Tim-3組細(xì)胞的遷移率則顯著上升(P0.05)。Transwell小室法檢測結(jié)果顯示,在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,與control組相比,siTim-3組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.05),而Tim-3組的侵襲細(xì)胞數(shù)則明顯增多(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,與control組相比siTim-3組的細(xì)胞凋亡率明顯增多(P0.05),而Tim-3組的細(xì)胞凋亡率則顯著降低(P0.05)。3.在 MCF-7 和 MDA-MB-231 細(xì)胞中,與 control 組相比,siTim-3 組 E-cadherin和TIMP-1蛋白的表達水平明顯增高(P0.05),而MMP-9、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達水平則顯著降低(P0.05);與control組相比,Tim-3組E-cadherin和TIMP-1蛋白的表達水平明顯降低(P0.05),而MMP-9、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達水平則明顯增高(P0.05)。[研究結(jié)論]1.Tim-3在乳腺癌細(xì)胞上表達,具有促進乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和抑制癌細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。2.Tim-3可能通過誘導(dǎo)EMT或者促進EMT過程推動乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,從而促進乳腺癌發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

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本文編號：2707002