【摘要】：背景腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種促癌因素協(xié)同作用的結(jié)果。腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移均依賴于血管生成(Angiogenesis)。腫瘤血管生成的過程受多種促血管生成因子和抗血管生成因子調(diào)控。VEGF是目前已知的腫瘤血管生成過程中最重要的促血管生成因子。其主要通過結(jié)合血管內(nèi)皮細胞膜上的VEGF受體(VEGFR)發(fā)揮其生物學(xué)功能,其中VEGFR2是VEGF的主要功能受體。VEGFR2在其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中含有多個酪氨酸磷酸化位點,這些位點活化以后可以調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞的存活、增殖和遷移。VEGF/VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤血管生成中起關(guān)鍵作用。因此,阻斷VEGF/VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制腫瘤發(fā)展。T4噬菌體表面展示技術(shù)是利用T4噬菌體表面的兩種非必需外殼蛋白(SOC和HOC)在噬菌體表面展示外源蛋白的蛋白表達系統(tǒng)。與M13、λ和T7噬菌體相比,T4噬菌體含有更大的基因組,因此它可以展示更大分子量的外源蛋白。外源蛋白通過與SOC或HOC融合而在T4噬菌體表面展示,同時保持相對獨立的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。目前,T4噬菌體展示技術(shù)主要用于疫苗的設(shè)計、肽文庫構(gòu)建和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究。如人類免疫缺陷病毒(HIV)、口蹄疫病毒(FMDV)和豬瘟病毒(CSFV)的疫苗的研發(fā)。在本研究中,我們構(gòu)建了展示VEGFR2胞外結(jié)構(gòu)域的T4重組噬菌體(T4-VEGFR2),研究其抗血管生成活性。通過建立Lewis肺癌(LLC)和結(jié)腸癌(CC)小鼠模型,研究T4-VEGFR2重組噬菌體在抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移中的作用。目的構(gòu)建表面展示VEGFR2胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的T4-VEGFR2重組噬菌體,利用體外和體內(nèi)實驗研究其抗腫瘤血管生成能力,為進一步臨床實驗提供科學(xué)依據(jù)。方法1.合成人VEGFR2(hVEGFR2)和小鼠VEGFR2(mVEGFR2)的胞外區(qū)片段核酸編碼序列。利用PCR對含有不同長度結(jié)構(gòu)域的mVEGFR2和hVEGFR2基因片段進行擴增,然后將擴增片段連接到pJKS質(zhì)粒上,構(gòu)建pJKS-VEGFR2重組質(zhì)粒。2.將pJKS-VEGFR2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21化學(xué)感受態(tài)細胞。然后將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21接種感染復(fù)數(shù)為0.5的T4-e~-噬菌體,使T4噬菌體與pJKS-VEGFR2質(zhì)粒進行同源重組,構(gòu)建T4-VEGFR2重組噬菌體。3.使用雙層瓊脂法擴增來自單個噬菌斑的候選T4-VEGFR2重組噬菌體,利用噬菌斑PCR和流式細胞術(shù)鑒定篩選T4-VEGFR2重組噬菌體。4.利用酶聯(lián)免疫吸附-噬菌體滴定(ELISA-titer)試驗和噬菌體-酶聯(lián)免疫吸附試驗(phage-ELISA)檢測T4-VEGFR2重組噬菌體與VEGF的結(jié)合能力。野生型T4噬菌體(T4-W)在實驗中作為對照。5.利用MTT和Trans-well試驗研究T4-VEGFR2重組噬菌體對VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移的抑制作用。利用磷酸化特異性流式細胞術(shù)(Phospho-specific Flow cytometry)分析T4-VEGFR2重組噬菌體對VEGF誘導(dǎo)VEGFR2及其下游信號的磷酸化的作用。6.建立Lewis肺癌(LLC)和結(jié)腸癌(CC)小鼠皮下移植瘤模型,隨機分成T4-VEGFR2重組噬菌體治療組、野生噬菌體T4治療組和PBS治療組,通過測量在體腫瘤體積及觀察荷瘤小鼠生存期,分析T4-VEGFR2重組噬菌體的體內(nèi)抗腫瘤能力;對腫瘤組織中微血管進行免疫組織化學(xué)染色,分析T4-VEGFR2重組噬菌體的體內(nèi)抗血管生成能力。結(jié)果1.成功構(gòu)建T4-VEGFR2重組噬菌體,經(jīng)噬菌斑PCR、流式細胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn),VEGFR2基因片段成功插入T4噬菌體基因組,VEGFR2蛋白成功表達并且展示于T4噬菌體的表面。2.ELISA-Titer和phage-ELISA試驗證實T4-VEGFR2重組噬菌體可以特異性結(jié)合VEGF,T4-VEGFR2-1-7噬菌體與VEGF結(jié)合能力最強。3.T4-VEGFR2重組噬菌體可以抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移。4.T4-VEGFR2重組噬菌體可以抑制VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2及其下游信號磷酸化。5.T4-VEGFR2重組噬菌體能夠抑制小鼠在體移植瘤生長并延長荷瘤小鼠的存活時間。6.T4-VEGFR2重組噬菌體能夠降低小鼠移植瘤微血管密度(MVD)。結(jié)論T4-VEGFR2重組噬菌體能夠抑制VEGF介導(dǎo)的腫瘤血管生成,抑制腫瘤進展,為抗腫瘤血管生成治療提供一種新的方法。
【圖文】：

4實驗結(jié)果4 實驗結(jié)果4.1 VEGFR2 胞外結(jié)構(gòu)域在 T4 噬菌體表面的展示為了直觀的顯示T4噬菌體展示VEGFR2的原理，我們繪制了T4-VEGFR2重組體的構(gòu)建模式圖(圖1)。首先，將攜帶編碼VEGFR2胞外區(qū)不同長度的基因片段與質(zhì)粒連接，，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細胞中以進行同源重組并整合到菌體基因組中。在T4噬菌體繁殖的過程中，整合到噬菌體基因組的VEGFR2基因經(jīng)過表達和包裝，以VEGFR2-SOC融合蛋白的形式自動的展示在T4噬菌體表面

所有的噬菌體都顯示出預(yù)期分子量大小的條帶（圖2A和2B）。圖 2 利用噬菌斑 PCR 技術(shù)鑒定 T4-VEGFR2 重組噬菌體注：A 為 PCR 鑒定 T4-mVEGFR2 重組噬菌體；B 為 PCR 鑒定 T4-hVEGFR2 重組噬菌體。為了驗證VEGFR2蛋白是否已經(jīng)成功展示于噬菌體的表面，我們將噬菌斑包被于磁珠上，然后使用流式細胞術(shù)檢測VEGFR2蛋白的表達。如圖3A和3B所示，除T4-W噬菌體外，T4-mVEGFR2-1-4、T4-mVEGFR2-1-5、T4-mVEGFR2-1-6、T4-mVEGFR2-1-7和T4-hVEGFR2-1-4、T4-hVEGFR2-1-5、T4-hVEGFR2-1-6及T4-hVEGFR2-1-7噬菌體均表達相應(yīng)的VEGFR2蛋白。以上結(jié)果說明，VEGFR2基因成功插入T4噬菌體的基因組，并且成功展示于T4噬菌體的表面。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2

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