發(fā)布時(shí)間：2020-06-10 16:24

【摘要】：慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是慢性白血病中最常見(jiàn)的一種類型,約占成人白血病的15%。在全球范圍內(nèi),慢性粒細(xì)胞性白血病的發(fā)病率為1～2/10萬(wàn),在中國(guó)約為0.36～1/10萬(wàn),以中老年人為主。BCR-ABL1蛋白的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)-伊馬替尼(IM)的出現(xiàn),徹底改變了 CML的治療方式,使CML患者每年的相關(guān)死亡率從10～20%降到了 1～2%,10年生存期也由10～20%提高到80～90%。TKI藥物的不斷出現(xiàn),為維持CML患者的長(zhǎng)期緩解狀態(tài)帶來(lái)了美好的前景。IM使CML從一種致命的惡性疾病變成了 一種慢性疾病。然而,約20～40%新診斷的CML慢性期患者,最終因?yàn)樗幬锏牟涣挤磻?yīng)或耐藥需要更換治療方式。耐藥的主要原因可分為BCR-ABL1酪氨酸激酶依賴性耐藥和非依賴性耐藥,依賴性耐藥主要與]00多種酪氨酸激酶區(qū)突變相關(guān)。而在非依賴性耐藥中,雖然TKI藥物成功抑制了 BCR-ABL1激酶的活性,但是旁路信號(hào)通路的激活,彌補(bǔ)了酪氨酸激酶活性的損失,可促使CML細(xì)胞持續(xù)增殖,凋亡下調(diào),最終導(dǎo)致TKI耐藥。然而,引起B(yǎng)CR-ABL1非依賴性耐藥的相關(guān)機(jī)制尚未明確。鑒于上述原因,本研究針對(duì)CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥,通過(guò)臨床病例信息、骨髓/外周血樣本檢測(cè)和體外細(xì)胞模型構(gòu)建等方式,利用高通量測(cè)序以及CRISPR/Cas9基因編輯等實(shí)驗(yàn)技術(shù),初步探討了 BCR-ABL1非依賴性耐藥相關(guān)的異�；�、信號(hào)通路及耐藥機(jī)制。第一部分慢性粒細(xì)胞白血病早期分子學(xué)反應(yīng)與伊馬替尼耐藥的臨床研究目的探討CML-CP患者早期分子學(xué)反應(yīng)與IM耐藥之間的關(guān)系。方法1.采用Sanger法測(cè)序,檢測(cè)IM耐藥患者的BCR-ABL1激酶區(qū)突變情況,明確其耐藥類型;2.分析早期分子學(xué)反應(yīng)與IM治療、耐藥的關(guān)系;3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:年齡和時(shí)間等變量采用中位數(shù)描述,不同組間分類資料的比較采用χ2檢驗(yàn),兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.198例未檢出激酶區(qū)突變的IM耐藥患者,早期服用羥基脲、馬利蘭或干擾素作為初始治療藥物的比例較高(43%),且非IM藥物使用時(shí)間越長(zhǎng),后期出現(xiàn)無(wú)激酶區(qū)突變的耐藥患者比例越高;2.初始使用非1M藥物的時(shí)間越長(zhǎng),患者BCR-ABL13mon10%的風(fēng)險(xiǎn)越高,IM耐藥時(shí)無(wú)激酶區(qū)突變的比例越高;3.當(dāng)BCR—ABL13mon≤10%,BCR-ABL16mon1%的患者中,耐藥發(fā)生時(shí)檢出激酶區(qū)突變的比例較高。結(jié)論1.CML患者IM治療前,干擾素和羥基脲、馬利蘭等細(xì)胞毒藥物的使用,可能會(huì)造成患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥;2.BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥,可能會(huì)導(dǎo)致CML患者3個(gè)月時(shí)的分子學(xué)反應(yīng)較差,但不影響IM出現(xiàn)耐藥的時(shí)間:3.CML患者6個(gè)月時(shí)BCR-ABLl水平升高,提示可能出現(xiàn)BCR-ABL1激酶區(qū)突變導(dǎo)致的繼發(fā)耐藥。第二部分高通量測(cè)序技術(shù)篩選慢性粒細(xì)胞白血病BCR-ABL1非依賴耐藥相關(guān)基因目的高通量測(cè)序技術(shù)篩選CML患者中BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥相關(guān)的異�；�。方法1.采用高通量測(cè)序技術(shù),以口腔粘膜為對(duì)照,篩選BCR-ABL1非依賴性耐藥相關(guān)基因;2.采用Sanger法測(cè)序,驗(yàn)證347例CML耐藥患者中相關(guān)基因突變頻率;3.檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平,進(jìn)一步分析可能存在的耐藥原因;4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,不同組間分類資料的比較采用χ2檢驗(yàn),兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.19例無(wú)BCR-ABL1激酶區(qū)突變的IM耐藥患者,采用高通量測(cè)序技術(shù)篩查578個(gè)腫瘤相關(guān)基因,篩選結(jié)果提示,KMT2CK339N和RUNX1 H214P可能與BCR-ABL1非依賴性耐藥相關(guān);2.無(wú)激酶區(qū)突變的198例CMLIM耐藥患者中,檢出25例KMT2CK339N突變,其突變頻率明顯高于攜帶激酶區(qū)突變的耐藥患者,而RUNX1 H214P在二組間的突變頻率較低,且無(wú)明顯差異;3.KMT2C mRNA表達(dá)水平與IM耐藥類型及KMT2C K339N突變無(wú)相關(guān)性。結(jié)論1.KMT2C K339N不伴隨KMT2C mRNA表達(dá)水平的改變,提示K339N點(diǎn)突變可能造成KMT2C蛋白功能學(xué)上的異常;2.KMT2C K339N可能激活相關(guān)旁路信號(hào)通路,導(dǎo)致CML患者BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥。第三部分KMT2C調(diào)控H3K4單甲基化與慢性粒細(xì)胞白血病BCR-ABL1非依賴耐藥的機(jī)制研究目的進(jìn)一步明確KMT2CK339N點(diǎn)突變與BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥的關(guān)系及機(jī)制。方法1.采用Western Blot法,分析在CML中,KMT2CK339N與不同H3K4甲基化修飾間的關(guān)系;2.通過(guò) Real-time RT-PCR 和 Western Blot 法,分析 KMT2C K339N 與PI3K/AKT信號(hào)通路間的關(guān)系;3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.H3K4甲基化水平分析,MT2CK339N患者的H3K4mel水平明顯低于KMT2CWT患者,而H3K4me2和H3K4me3在二者間均沒(méi)有明顯差異;2.KMT2CK339N患者中PTEN和P21的水平均明顯下降,AKT Thr308、AKT Ser473 和 XIAP 的水平明顯升高,而 PI3K p110α AKT、BCL-2、BAX 和 P27的表達(dá)水平均與KMT2CWT患者沒(méi)有明顯差異。結(jié)論1.KMT2C K339N可能通過(guò)下調(diào)H3K4mel水平來(lái)激活旁路信號(hào)通路,引起B(yǎng)CR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥;2.H3K4mel下調(diào)可能通過(guò)抑制PTEN表達(dá),進(jìn)而磷酸化AKT,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制蛋白P21和凋亡抑制蛋白XIAP的表達(dá)水平,最終影響CML細(xì)胞的非依賴性耐藥。第四部分CRISPR/Cas9構(gòu)建KMT2CK339N K562細(xì)胞模型及相關(guān)機(jī)制研究目的構(gòu)建KMT2CK339N K562細(xì)胞模型,進(jìn)一步明確相關(guān)機(jī)制。方法1.采用CRISPR/Cas9結(jié)合ssODN,構(gòu)建KMT2CK339N K562細(xì)胞模型;2.使用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和甲基纖維素克隆形成實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步明確KMT2CK339N K562的細(xì)胞增殖情況;3.使用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步明確KMT2CK339N K562的細(xì)胞凋亡情況;4.采用 Real-time RT-PCR 和 Western Blot 法,進(jìn)一步明確KMT2C K339N突變與H3K4單甲基化及P13K/AKT信號(hào)通路的關(guān)系;5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.使用CRISPR/Cas9,結(jié)合ssODN,將K562細(xì)胞定點(diǎn)敲入KMT2CK339N點(diǎn)突變,構(gòu)建KMT2CK339N K562細(xì)胞模型;2.KMT2CK339NK562細(xì)胞增殖能力提高,而凋亡水平下降;3.KMT2CK339N K562細(xì)胞的H3K4的單甲基化水平下降,而PTEN、P21、BCL-2、BAX 和 P27 的水平均明顯下降,AKTThr308、AKT Ser473 和XIAP 的水平明顯升高,而PI3K p110α和AKT的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。結(jié)論KMT2C K339N突變可影響自身組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶功能,下調(diào)H3K4me1水平,進(jìn)而抑制P13K/AKT信號(hào)通路中負(fù)性調(diào)節(jié)因子PTEN的表達(dá),上調(diào)AKT的磷酸化水平,影響CML細(xì)胞的凋亡和增殖,最終導(dǎo)致CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥。
【圖文】：

Ｃｈｒｏｍｅ邋Ｐｈａｓｅ，邋ＣＰ）患者服用伊馬替尼，可以達(dá)到分子學(xué)緩解［２Ｕ。然而，約２０？４０％新診斷的ＣＭＬ－Ｃ反應(yīng)或耐藥需要更換治療方式［２２＿２７］。耐藥的主要激酶依賴性耐藥和非依賴性耐藥。在ＢＣＲ－ＡＢＬ１發(fā)現(xiàn)超過(guò)１００多種ＡＢＬ激酶區(qū)突變與伊馬替尼耐代ＴＫＩ耐藥相關(guān)，其主要集中于能夠結(jié)合三磷酸合位點(diǎn)和負(fù)責(zé)催化的Ａ環(huán)（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋Ｌｏｏｐ）等［成的伊馬替尼耐藥僅占全部耐藥的３０？４０％［３？３３］。激酶非依賴性耐藥中，ＴＫＩ藥物成功抑制了邋ＢＣＲ－信號(hào)通路的激活，例如：ＳＲＣ、ＰＩ３Ｋ、ＫＲＡＳ和ＪＡ性的損失，可導(dǎo)致ＣＭＬ細(xì)胞的持續(xù)增殖［３４＿３８］（圖１．信號(hào)旁路激活的相關(guān)研究較少，其機(jī)制尚未明確。影響了邋ＣＭＬ患者遠(yuǎn)期的療效評(píng)估和治療方式的選激酶非依賴性耐藥的早期評(píng)價(jià)對(duì)于ＣＭＬ初始ＴＫＩＭＬ治療方式的選擇具有重要的臨床價(jià)值。逡逑

第一部分慢性粒細(xì)胞白血病早期分子學(xué)反應(yīng)與伊馬替尼耐藥的臨床研宄逡逑沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變。已檢出的突變包含在激酶區(qū)２２個(gè)位點(diǎn)上的３８種突變類型，其逡逑中Ｐ環(huán)突變（位點(diǎn)２４４－２５５）邋５８例（３９％），ＩＭ結(jié)合位置突變（位點(diǎn)３１５和３１７）逡逑４５例（３０％），催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)突變（位點(diǎn)３５０－３６３）邋４０例（２７％），活化環(huán)（Ａ－ｌｏｏｐ）逡逑突變（位點(diǎn)３８１－４０２）邋６例（３％）。突變頻率較高的位點(diǎn)和類型依次為Ｔ３１５Ｉ邋（３４，逡逑２３％），Ｅ２５５Ｋ／Ｖ邋（２８，１９％），Ｆ３５９Ｃ／Ｖ／Ｉ邋（２１，１４％），Ｍ２４４Ｖ邋（１５，１０％），逡逑Ｍ３５１ＴＡ＾（１６，邋１１％），邋Ｙ２５３Ｆ／Ｈ（１３，邋９％），邋Ｆ３１７ＬＣ１０，邋７％），邋Ｇ２５０Ｅ邋（９，邋６％），逡逑Ｑ２５２Ｈ邋（９，邋６％）等，其中復(fù)合突變２６例（１９％）（圖１．２）。逡逑１９８例ＩＭ耐藥患者并未檢出突變，根據(jù)其相關(guān)影響因素及治療過(guò)程進(jìn)行對(duì)逡逑比分析（表１．２）。發(fā)現(xiàn)無(wú)突變ＩＭ耐藥患者中，女性患者比例較高，且患者年齡逡逑較大。所有發(fā)生ＩＭ耐藥的患者中，有１３１例（３８％）患者確診后，因各種因素逡逑選擇羥基脲、馬利蘭或干擾素作為初始治療藥物，而這部分患者在未檢出突變逡逑的耐藥患者中比例較高（４３％邋ｗ．３１％），且隨著非Ｍ藥物使用時(shí)間越長(zhǎng)，此類逡逑患者比例越高。而在出現(xiàn)激酶區(qū)突變的耐藥患者中，初始直接使用Ｍ的患者較逡逑多（６９％）。針對(duì)發(fā)生激酶區(qū)突變的耐藥患者與無(wú)突變的耐藥患者，二者的�。砟湾义纤帟r(shí)間無(wú)明顯差異。逡逑
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733.72

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本文編號(hào)：2706549