【摘要】：慢性粒細胞白血病(CML)是慢性白血病中最常見的一種類型,約占成人白血病的15%。在全球范圍內(nèi),慢性粒細胞性白血病的發(fā)病率為1～2/10萬,在中國約為0.36～1/10萬,以中老年人為主。BCR-ABL1蛋白的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)-伊馬替尼(IM)的出現(xiàn),徹底改變了 CML的治療方式,使CML患者每年的相關(guān)死亡率從10～20%降到了 1～2%,10年生存期也由10～20%提高到80～90%。TKI藥物的不斷出現(xiàn),為維持CML患者的長期緩解狀態(tài)帶來了美好的前景。IM使CML從一種致命的惡性疾病變成了 一種慢性疾病。然而,約20～40%新診斷的CML慢性期患者,最終因為藥物的不良反應或耐藥需要更換治療方式。耐藥的主要原因可分為BCR-ABL1酪氨酸激酶依賴性耐藥和非依賴性耐藥,依賴性耐藥主要與]00多種酪氨酸激酶區(qū)突變相關(guān)。而在非依賴性耐藥中,雖然TKI藥物成功抑制了 BCR-ABL1激酶的活性,但是旁路信號通路的激活,彌補了酪氨酸激酶活性的損失,可促使CML細胞持續(xù)增殖,凋亡下調(diào),最終導致TKI耐藥。然而,引起B(yǎng)CR-ABL1非依賴性耐藥的相關(guān)機制尚未明確。鑒于上述原因,本研究針對CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥,通過臨床病例信息、骨髓/外周血樣本檢測和體外細胞模型構(gòu)建等方式,利用高通量測序以及CRISPR/Cas9基因編輯等實驗技術(shù),初步探討了 BCR-ABL1非依賴性耐藥相關(guān)的異�；颉⑿盘柾芳澳退帣C制。第一部分慢性粒細胞白血病早期分子學反應與伊馬替尼耐藥的臨床研究目的探討CML-CP患者早期分子學反應與IM耐藥之間的關(guān)系。方法1.采用Sanger法測序,檢測IM耐藥患者的BCR-ABL1激酶區(qū)突變情況,明確其耐藥類型;2.分析早期分子學反應與IM治療、耐藥的關(guān)系;3.統(tǒng)計學處理:年齡和時間等變量采用中位數(shù)描述,不同組間分類資料的比較采用χ2檢驗,兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗和獨立樣本t檢驗,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義,采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1.198例未檢出激酶區(qū)突變的IM耐藥患者,早期服用羥基脲、馬利蘭或干擾素作為初始治療藥物的比例較高(43%),且非IM藥物使用時間越長,后期出現(xiàn)無激酶區(qū)突變的耐藥患者比例越高;2.初始使用非1M藥物的時間越長,患者BCR-ABL13mon10%的風險越高,IM耐藥時無激酶區(qū)突變的比例越高;3.當BCR—ABL13mon≤10%,BCR-ABL16mon1%的患者中,耐藥發(fā)生時檢出激酶區(qū)突變的比例較高。結(jié)論1.CML患者IM治療前,干擾素和羥基脲、馬利蘭等細胞毒藥物的使用,可能會造成患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥;2.BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥,可能會導致CML患者3個月時的分子學反應較差,但不影響IM出現(xiàn)耐藥的時間:3.CML患者6個月時BCR-ABLl水平升高,提示可能出現(xiàn)BCR-ABL1激酶區(qū)突變導致的繼發(fā)耐藥。第二部分高通量測序技術(shù)篩選慢性粒細胞白血病BCR-ABL1非依賴耐藥相關(guān)基因目的高通量測序技術(shù)篩選CML患者中BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥相關(guān)的異常基因。方法1.采用高通量測序技術(shù),以口腔粘膜為對照,篩選BCR-ABL1非依賴性耐藥相關(guān)基因;2.采用Sanger法測序,驗證347例CML耐藥患者中相關(guān)基因突變頻率;3.檢測相關(guān)基因表達水平,進一步分析可能存在的耐藥原因;4.統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差描述,不同組間分類資料的比較采用χ2檢驗,兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗和獨立樣本t檢驗,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義,采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1.19例無BCR-ABL1激酶區(qū)突變的IM耐藥患者,采用高通量測序技術(shù)篩查578個腫瘤相關(guān)基因,篩選結(jié)果提示,KMT2CK339N和RUNX1 H214P可能與BCR-ABL1非依賴性耐藥相關(guān);2.無激酶區(qū)突變的198例CMLIM耐藥患者中,檢出25例KMT2CK339N突變,其突變頻率明顯高于攜帶激酶區(qū)突變的耐藥患者,而RUNX1 H214P在二組間的突變頻率較低,且無明顯差異;3.KMT2C mRNA表達水平與IM耐藥類型及KMT2C K339N突變無相關(guān)性。結(jié)論1.KMT2C K339N不伴隨KMT2C mRNA表達水平的改變,提示K339N點突變可能造成KMT2C蛋白功能學上的異常;2.KMT2C K339N可能激活相關(guān)旁路信號通路,導致CML患者BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥。第三部分KMT2C調(diào)控H3K4單甲基化與慢性粒細胞白血病BCR-ABL1非依賴耐藥的機制研究目的進一步明確KMT2CK339N點突變與BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥的關(guān)系及機制。方法1.采用Western Blot法,分析在CML中,KMT2CK339N與不同H3K4甲基化修飾間的關(guān)系;2.通過 Real-time RT-PCR 和 Western Blot 法,分析 KMT2C K339N 與PI3K/AKT信號通路間的關(guān)系;3.統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差描述,兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗和獨立樣本t檢驗,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義,采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1.H3K4甲基化水平分析,MT2CK339N患者的H3K4mel水平明顯低于KMT2CWT患者,而H3K4me2和H3K4me3在二者間均沒有明顯差異;2.KMT2CK339N患者中PTEN和P21的水平均明顯下降,AKT Thr308、AKT Ser473 和 XIAP 的水平明顯升高,而 PI3K p110α AKT、BCL-2、BAX 和 P27的表達水平均與KMT2CWT患者沒有明顯差異。結(jié)論1.KMT2C K339N可能通過下調(diào)H3K4mel水平來激活旁路信號通路,引起B(yǎng)CR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥;2.H3K4mel下調(diào)可能通過抑制PTEN表達,進而磷酸化AKT,調(diào)節(jié)細胞周期抑制蛋白P21和凋亡抑制蛋白XIAP的表達水平,最終影響CML細胞的非依賴性耐藥。第四部分CRISPR/Cas9構(gòu)建KMT2CK339N K562細胞模型及相關(guān)機制研究目的構(gòu)建KMT2CK339N K562細胞模型,進一步明確相關(guān)機制。方法1.采用CRISPR/Cas9結(jié)合ssODN,構(gòu)建KMT2CK339N K562細胞模型;2.使用CCK8細胞增殖實驗、EdU細胞增殖實驗和甲基纖維素克隆形成實驗,進一步明確KMT2CK339N K562的細胞增殖情況;3.使用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡實驗,進一步明確KMT2CK339N K562的細胞凋亡情況;4.采用 Real-time RT-PCR 和 Western Blot 法,進一步明確KMT2C K339N突變與H3K4單甲基化及P13K/AKT信號通路的關(guān)系;5.統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差描述,兩樣本定量資料的比較采用方差齊性檢驗和獨立樣本t檢驗,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義,采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1.使用CRISPR/Cas9,結(jié)合ssODN,將K562細胞定點敲入KMT2CK339N點突變,構(gòu)建KMT2CK339N K562細胞模型;2.KMT2CK339NK562細胞增殖能力提高,而凋亡水平下降;3.KMT2CK339N K562細胞的H3K4的單甲基化水平下降,而PTEN、P21、BCL-2、BAX 和 P27 的水平均明顯下降,AKTThr308、AKT Ser473 和XIAP 的水平明顯升高,而PI3K p110α和AKT的表達水平無明顯變化。結(jié)論KMT2C K339N突變可影響自身組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶功能,下調(diào)H3K4me1水平,進而抑制P13K/AKT信號通路中負性調(diào)節(jié)因子PTEN的表達,上調(diào)AKT的磷酸化水平,影響CML細胞的凋亡和增殖,最終導致CML患者的BCR-ABL1酪氨酸激酶非依賴性耐藥。
【圖文】：

Ｃｈｒｏｍｅ邋Ｐｈａｓｅ，邋ＣＰ）患者服用伊馬替尼，可以達到分子學緩解［２Ｕ。然而，約２０？４０％新診斷的ＣＭＬ－Ｃ反應或耐藥需要更換治療方式［２２＿２７］。耐藥的主要激酶依賴性耐藥和非依賴性耐藥。在ＢＣＲ－ＡＢＬ１發(fā)現(xiàn)超過１００多種ＡＢＬ激酶區(qū)突變與伊馬替尼耐代ＴＫＩ耐藥相關(guān)，其主要集中于能夠結(jié)合三磷酸合位點和負責催化的Ａ環(huán)（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋Ｌｏｏｐ）等［成的伊馬替尼耐藥僅占全部耐藥的３０？４０％［３？３３］。激酶非依賴性耐藥中，ＴＫＩ藥物成功抑制了邋ＢＣＲ－信號通路的激活，例如：ＳＲＣ、ＰＩ３Ｋ、ＫＲＡＳ和ＪＡ性的損失，可導致ＣＭＬ細胞的持續(xù)增殖［３４＿３８］（圖１．信號旁路激活的相關(guān)研究較少，其機制尚未明確。影響了邋ＣＭＬ患者遠期的療效評估和治療方式的選激酶非依賴性耐藥的早期評價對于ＣＭＬ初始ＴＫＩＭＬ治療方式的選擇具有重要的臨床價值。逡逑

第一部分慢性粒細胞白血病早期分子學反應與伊馬替尼耐藥的臨床研宄逡逑沒有發(fā)現(xiàn)突變。已檢出的突變包含在激酶區(qū)２２個位點上的３８種突變類型，其逡逑中Ｐ環(huán)突變（位點２４４－２５５）邋５８例（３９％），ＩＭ結(jié)合位置突變（位點３１５和３１７）逡逑４５例（３０％），催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)突變（位點３５０－３６３）邋４０例（２７％），活化環(huán)（Ａ－ｌｏｏｐ）逡逑突變（位點３８１－４０２）邋６例（３％）。突變頻率較高的位點和類型依次為Ｔ３１５Ｉ邋（３４，逡逑２３％），Ｅ２５５Ｋ／Ｖ邋（２８，１９％），Ｆ３５９Ｃ／Ｖ／Ｉ邋（２１，１４％），Ｍ２４４Ｖ邋（１５，１０％），逡逑Ｍ３５１ＴＡ＾（１６，邋１１％），邋Ｙ２５３Ｆ／Ｈ（１３，邋９％），邋Ｆ３１７ＬＣ１０，邋７％），邋Ｇ２５０Ｅ邋（９，邋６％），逡逑Ｑ２５２Ｈ邋（９，邋６％）等，其中復合突變２６例（１９％）（圖１．２）。逡逑１９８例ＩＭ耐藥患者并未檢出突變，根據(jù)其相關(guān)影響因素及治療過程進行對逡逑比分析（表１．２）。發(fā)現(xiàn)無突變ＩＭ耐藥患者中，女性患者比例較高，且患者年齡逡逑較大。所有發(fā)生ＩＭ耐藥的患者中，有１３１例（３８％）患者確診后，因各種因素逡逑選擇羥基脲、馬利蘭或干擾素作為初始治療藥物，而這部分患者在未檢出突變逡逑的耐藥患者中比例較高（４３％邋ｗ．３１％），且隨著非Ｍ藥物使用時間越長，此類逡逑患者比例越高。而在出現(xiàn)激酶區(qū)突變的耐藥患者中，初始直接使用Ｍ的患者較逡逑多（６９％）。針對發(fā)生激酶區(qū)突變的耐藥患者與無突變的耐藥患者，二者的�。砟湾义纤帟r間無明顯差異。逡逑
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.72

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本文編號：2706549