【摘要】：目的篩選出與食管鱗癌干細胞放射敏感性相關(guān)的LncRNA。方法對人食管鱗癌細胞株Eca109進行無血清培養(yǎng)形成富集干細胞的懸浮細胞球(瘤球細胞組)和正常血清培養(yǎng)形成的細胞(貼壁細胞組)。分別通過CCK8細胞增殖實驗和克隆形成等實驗初步確定瘤球細胞是否具有干細胞特性。驗證CD44是否為食管鱗癌干細胞標志物。通過流式分選技術(shù)從瘤球細胞組中分選出CD44+食管鱗癌干細胞,從貼壁細胞組中分選出CD44-食管鱗癌細胞,再用LncRNA高通量測序分析CD44+食管鱗癌干細胞與CD44-食管鱗癌細胞細胞間的LncRNA差異表達譜,并應(yīng)用Real-time PCR方法驗證篩選與食管鱗癌干細胞放射敏感性相關(guān)的特異性LncRNA。結(jié)果1.人食管鱗癌干細胞的細胞球(瘤球細胞)培養(yǎng)條件的摸索及確定:結(jié)果顯示使用1×10~5個/ml密度進行培養(yǎng)所獲得瘤球細胞生長狀態(tài)良好。2.細胞增殖實驗結(jié)果顯示:細胞培養(yǎng)24h、48h、72h后瘤球細胞組的吸光度值較貼壁細胞組均明顯的升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。瘤球細胞組細胞克隆形成率較貼壁細胞組高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.克隆形成實驗結(jié)果顯示:根據(jù)放射敏感性參數(shù)分析,與貼壁細胞組比較,瘤球細胞組的D0、Dq、N和SF2值明顯升高,放射增敏比為1.556。4.流式細胞儀檢測CD44結(jié)果顯示:瘤球細胞組CD44的表達率和量均較貼壁細胞組高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.LncRNA高通量測序分析結(jié)果顯示:流式分選技術(shù)分選出的CD44+食管鱗癌干細胞與CD44-食管鱗癌細胞,采用LncRNA高通量測序分析,并選取|log2Ratio|≥1和q0.05的基因作為顯著差異表達篩選條件,篩得4961個基因在兩組細胞中表達呈顯著差異,與CD44-食管鱗癌細胞相比,CD44+食管鱗癌干細胞組2517個基因表達顯著上調(diào);2444個基因顯著下調(diào),其中mRNA3129個,1479,上調(diào),1695個下調(diào);lncRNA1832個,1038個上調(diào),794個下調(diào)。6.Realtime PCR結(jié)果顯示:選擇前10位差異性表達最大的LncRNA基因(其中CH17-360D5.2、CH17-360D5.3、AC113607.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.116589、MSTRG.15903上調(diào),RP13-895J2.7、MSTRG.73085下調(diào))進行驗證,結(jié)果顯示:MSTRG.73085表達下調(diào),其平均表達水平約為20.7倍(LncRNA高通量測序分析為49.3倍),CH17-360D5.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.15903表達上調(diào),其平均表達水平分別為2.7、8.7、3.7、5、7倍(LncRNA高通量測序分析分別為8.2、5.2、78.9、3、4.7倍)。結(jié)論1.人食管鱗癌細胞株Eca109無血清培養(yǎng)能夠獲得懸浮的富集人食管鱗癌干細胞的細胞球,CD44可能是人食管鱗癌干細胞的標志物。2.應(yīng)用LncRNA高通量測序結(jié)合Realtime PCR技術(shù)驗證篩查差異表達基因,與貼壁細胞組相比,其中MSTRG.73085在瘤球細胞組中表達顯著下調(diào),CH17-360D5.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.15903表達顯著上調(diào),這些差異性LncRNA基因有可能與食管鱗癌干細胞的放射敏感性相關(guān),有望成為食管鱗癌潛在的藥物治療新靶點和指導(dǎo)食管鱗癌的個體化放射治療。
【圖文】：

長情況如圖 1-3 所示，結(jié)果顯示使用 1×105個/ml 密度進行培養(yǎng)所獲得瘤長狀態(tài)良好，選擇該密度進行瘤球細胞的大量培養(yǎng)。Eca109 貼壁細胞和瘤球細胞的生長曲線正常培養(yǎng)的貼壁生長的 Eca109 細胞為貼壁細胞，分別測定 Eca109 貼壁球細胞在 0h，24h，，48h，72h 細胞活性，繪制瘤球與貼壁細胞生長曲線胞活性均高于貼壁細胞（P<0.05，圖 4，表 1）。表 1 Eca109 貼壁細胞與瘤球細胞的增殖情況對比別 0 24h 48h 72h細胞 0.1751±0.01382 0.4358±0.01831 0.7686±0.06916 1.460±0.0細胞 0.1430±0.01744 0.5703±0.04437 1.096±0.05481 1.698±0.0P 0.0271 0.0008 0.0005 0.004

瘤球細胞生長情況（×200，1×106個/ml）
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Jian-Lin Wang;Jing-Ping Yu;Zhi-Qiang Sun;Su-Ping Sun;;Radiobiological characteristics of cancer stem cells from esophageal cancer cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2014年48期

本文編號：2706239