發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 15:28

【摘要】：背景胰腺癌是一種惡性度高,侵襲性強(qiáng),預(yù)后極差的腫瘤�；颊咴诖_診時(shí)往往已屬疾病晚期,依賴內(nèi)科治療。以5-Fu,吉西他濱,紫杉醇,S-1等為主的標(biāo)準(zhǔn)化療方案給予胰腺癌患者的時(shí)間也僅8-10個(gè)月。目前厄洛替尼作為獲得美國FDA(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)的靶向藥延長生存期非常有限,急需找到有效的治療藥物。研究表明,很多腫瘤的轉(zhuǎn)錄過程異常激活,而抑制轉(zhuǎn)錄的藥物CDK7抑制劑-THZ1,是Gray實(shí)驗(yàn)室2014年研發(fā),第一個(gè)可以以共價(jià)鍵與CDK7結(jié)合,高效特異的抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的小分子抑制劑。目前在三陰性乳腺癌,小細(xì)胞肺癌,卵巢癌,AML,ALL等難治性腫瘤中得到證實(shí),可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。而在胰腺癌中,尚無此類報(bào)道,因此,擬準(zhǔn)備在胰腺癌中研究CDK7抑制劑THZ1的療效。方法實(shí)驗(yàn)分為三部分,第一部分為在胰腺癌細(xì)胞系中檢測(cè)CDK7抑制劑的療效,第二部分探討可能的CDK7下游作用靶點(diǎn),第三部分為分析胰腺癌患者標(biāo)本CDK7表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。在第一部分試驗(yàn),我們?cè)诓煌认侔┘?xì)胞系中加入CDK7抑制劑-THZ1,MTS測(cè)試十種胰腺癌細(xì)胞系增殖狀態(tài),Caspase3/7測(cè)試細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化,以及Westen blot檢測(cè)凋亡,周期,以及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的變化。更進(jìn)一步的,使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CDK7基因,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系增殖變化,以及Western檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白變化。在第二部分試驗(yàn),我們?cè)贑APAN2細(xì)胞系中,采用ChIP的實(shí)驗(yàn)方法,使用H3K27ac抗體,研究受THZ1作用,可能調(diào)控的下游通路。然后在胰腺癌細(xì)胞中,THZ1藥物處理,檢測(cè)RNA和蛋白水平相應(yīng)靶基因以及蛋白水平的變化。在第三部分試驗(yàn),使用免疫組化方法,檢測(cè)胰腺癌患者手術(shù)標(biāo)本CDK7表達(dá)水平,兩名病理醫(yī)生獨(dú)立評(píng)分。運(yùn)用Kaplan-Meier繪制生存曲線,log-rank檢驗(yàn)組間差異,以及多因素分析Cox模型檢測(cè)其與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫TCGA轉(zhuǎn)錄組結(jié)果,Kaplan-Meier繪制生存曲線,log-rank分析CDK7轉(zhuǎn)錄組水平與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果我們可以觀察到,在10種胰腺癌細(xì)胞系CAPAN2,PANC03.27,PSN-1,SW1990,Hs766T,PANC02.03,PANC10.05,PANC08.13,HUPT3,BXPC3 中,胰腺癌細(xì)胞對(duì) THZ1藥物非常敏感,加入THZ1之后,十種胰腺癌細(xì)胞系中增殖顯著降低,且平均藥物IC50甚至低于 200nM。CAPAN2,PANC03.27,SW1990,PSN-1,Hs766T 胰腺癌細(xì)胞加入 THZ1處理后,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,在CAPAN2以及PANC03.27細(xì)胞系中非常顯著。然而,不同于小細(xì)胞肺癌,卵巢癌,在胰腺癌細(xì)胞系中,THZ1對(duì)細(xì)胞周期并無顯著影響,這點(diǎn)與三陰性乳腺癌相同。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn),RNApolymerase II CTD(carboxy-terminal domain)的Ser5,7,2位點(diǎn)隨著THZ1藥物濃度增加或者藥物作用時(shí)間延長,其磷酸化水平降低,從而抑制轉(zhuǎn)錄。在CAPAN2,PANC03.27細(xì)胞系中,我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CDK7之后,CDK7蛋白水平基本沒有表達(dá),克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,腫瘤細(xì)胞增殖顯著受到抑制。凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP水平顯著增高,抗凋亡蛋白MCL1顯著下降。因此機(jī)制上可以證實(shí)胰腺癌細(xì)胞生長對(duì)CDK7蛋白的依賴。此后,在CAPAN2細(xì)胞系中,我們進(jìn)行了 ChIP實(shí)驗(yàn)。使用H3K27ac作為目標(biāo)抗體,研究發(fā)現(xiàn),THZ1可減弱H3K27ac與PIK3CA基因的結(jié)合。THZ1藥物處理細(xì)胞之后,PI3KCAmRNA表達(dá)水平也降低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)PI3K蛋白表達(dá)降低,磷酸化AKT降低,以及磷酸化的mTOR水平降低,推測(cè),THZ1可能抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。我們將胰腺癌術(shù)后患者CDK7蛋白表達(dá)水平按照強(qiáng)度跟范圍分為高低兩組,多因素分析顯示,CDK7蛋白高表達(dá)組總生存較CDK7蛋白低表達(dá)組生存期縮短(multivariateHR:1.25,95%CI:1.00-1.57),15 個(gè)月對(duì)比 18.2 個(gè)月(P=0.045)。TCGA公共數(shù)據(jù)庫分析顯示,CDK7轉(zhuǎn)錄組水平高表達(dá)患者預(yù)后顯著差于CDK7低表達(dá)患者,中位 OS 分別為 16.2 個(gè)月(95%CI:13.6-18.8)和 22.0 個(gè)月(95%CI:19.0-25.0),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。結(jié)論THZ1在胰腺癌細(xì)胞系中可高效結(jié)合CDK7蛋白,顯著抑制胰腺癌細(xì)胞增殖,引發(fā)胰腺癌細(xì)胞凋亡,抑制轉(zhuǎn)錄過程。在機(jī)制探索中,THZ1可能抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,從而抑制增殖過程。在胰腺癌患者中,CDK7分子水平高表達(dá),與較差的預(yù)后相關(guān)。CDK7抑制劑在胰腺癌中是一種頗具治療前景的藥物,期待進(jìn)一步的臨床試驗(yàn),為胰腺癌患者的治療帶來曙光。
【圖文】：

記染色實(shí)驗(yàn)方法逡逑描拍照逡逑用Ｖｅｃｔｒａ光譜定量病理分析系統(tǒng)和Ｐｏｌａｒｉｓ組織病片進(jìn)行觀察，隨機(jī)選�。祩�(gè)高倍視野（２００倍，照保存，待后續(xù)分析使用。所有圖像拍照采集及件工程師共同完成，二者均不知曉標(biāo)本對(duì)應(yīng)的臨２４逡逑

逑５．２多標(biāo)記染色光譜的合成逡逑利用ｉｎＦｏｒｍ軟件合成如下多標(biāo)光譜曲線，見圖２－３。逡逑：：，￣Ｋ逡逑；邋＼逡逑“邐ｉ？＿邐ｆ逡逑圖２－３多標(biāo)記染色合成光譜逡逑５．３圖像光譜拆分逡逑利用ｉｎＦｏｒｍ軟件，參考多標(biāo)光譜曲線，對(duì)采集的照片信息進(jìn)行拆分，分配偽逡逑彩，，得到多光譜圖像，見圖２－４、圖２－５。采集到的照片包含ＲＡＷ、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ逡逑兩類信息，經(jīng)拆分并分配偽彩后，形成ＣＤ８、ＣＤ３３、ＦｏｘＰ３、ＣＫ共４個(gè)單標(biāo)記逡逑圖像，經(jīng)疊加合成，形成最終的多標(biāo)記合成圖。逡逑２６逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

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2 吳瑾;唐寧;龔自珍;周潔菲;蔡威;;神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺干預(yù)MDSC的功能及影響腫瘤生長的研究[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年06期

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1 燕翔;NSCLC免疫微環(huán)境及全身免疫狀況對(duì)預(yù)后的影響研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2012年

本文編號(hào)：2703281