【摘要】：DLK1-DIO3印記簇位于人類(lèi)染色體14q32,包含DLK1、RTL1和DIO3這三個(gè)父源表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因,和幾個(gè)大小不一的母源表達(dá)的非編碼RNA。在這些非編碼RNA的基因區(qū)間內(nèi)和內(nèi)含子中,存在大量的C/Dsno RNAs和micro RNAs。父本甲基化的IG-DMR和Gtl2/MEG3-DMR是該印記簇內(nèi)起主要調(diào)控作用的兩個(gè)差異甲基化區(qū)域,先前研究顯示這兩個(gè)DMR區(qū)域的親本特異性敲除會(huì)對(duì)區(qū)間內(nèi)的基因表達(dá)及胚胎發(fā)育產(chǎn)生廣泛的影響。MEG8-DMR為DLK1-DIO3印記簇內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的母本差異甲基化區(qū)域,位于MEG8的第二個(gè)內(nèi)含子中。腺病毒載體和SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在小鼠Meg8-DMR附近的整合插入效應(yīng),導(dǎo)致了上下游基因表達(dá)的異常,使小鼠肝癌的發(fā)生率增高。這暗示MEG8-DMR可能作為一種重要的DNA調(diào)控序列,對(duì)上下游基因的表達(dá)和原發(fā)性肝癌發(fā)生存在相應(yīng)的調(diào)控作用。本文利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在人源肝癌Huh7細(xì)胞系中敲除MEG8-DMR,研究MEG8-DMR對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)變化和Huh7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。我們構(gòu)建Cas9-MEG8-DMR重組載體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,結(jié)果顯示其可在細(xì)胞基因組水平有效敲除MEG8-DMR。敲除MEG8-DMR后在m RNA水平上,DLK1、DIO3、IGF2的表達(dá)水平下調(diào);MEG3、MEG8的表達(dá)水平無(wú)明顯變化,MEG9的表達(dá)水平上調(diào);同樣mi R-370的表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)。MEG8-DMR的敲除使細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力減弱,并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡;細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移侵襲能力、細(xì)胞周期并沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。綜上所述,MEG8-DMR對(duì)于相關(guān)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用,并以此影響Huh7細(xì)胞的生物學(xué)行為。這些結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步探究MEG8-DMR的調(diào)控功能和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
【圖文】：

.4 DLK1-DIO3 印記區(qū)域介紹.4.1 DLK1-DIO3 印記區(qū)域概述基因組印記作為一種表觀(guān)遺傳現(xiàn)象，其獨(dú)特性在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有十分的作用。事實(shí)上，許多印跡基因都已被證明在胚胎和癌癥發(fā)生中起作用[34]。，繼承父母雙親的印跡等位基因?qū)τ谡５陌l(fā)育是必不可少的。DLK1-DIO3印記區(qū)域位于在小鼠染色體12qF1、人類(lèi)染色體14q32.1-32.31，因組區(qū)域的長(zhǎng)度約為1Mb；該印記區(qū)間包含三種蛋白質(zhì)編碼基因DLK1/PEGL1/PEG11和DIO3（小鼠中表示為Dlk1/Peg9，Rt11/Peg11和Dio3）,它們都是表達(dá)的基因，，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和并在胚胎組織中高度表達(dá)；此外，還包含有幾非編碼RNA(lncRNA)基因：GTL2/MEG3、MEG8和MEG9 (小鼠中表示tl2/Meg3、Rian/Irm/Meg8、Mirg/Meg9)。這些母系非編碼RNA大多是為大型多子轉(zhuǎn)錄本的一部分；但AK050713、AK053394在人類(lèi)未發(fā)現(xiàn)同系物。在這些lncR因間區(qū)域內(nèi)分布著大量的C/D snoRNAs和miRNAs。RTL1和DIO3都存在表達(dá)反 錄 物 ， 抗 PEG11/antiRTL1 和 DIO3OS （ 小 鼠 中 表 示 為 antiRtl1/Peg11io3as/Dio3os）[35]。DLK1-DIO3印記區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖如圖1-1所示。

有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)位于 MEG8-DMR 上下游 2 kb 序列區(qū)間內(nèi)，其中位點(diǎn) CBS-3 的核心基序恰好位于 MEG8-DMR 內(nèi)。MEG8-DMR 的甲基潛在改變 DMR 對(duì) CTCF 的可結(jié)合性，因此可能是區(qū)域性的絕緣作用�？赡茉蚴� MEG8 從母親等位基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。 MEG8-DMR 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的未知反義轉(zhuǎn)錄物相關(guān)聯(lián)，這也類(lèi)似與位于人 11p15.5 印記群OT1[86]。在許多已知印記區(qū)域如 H19-ICR、KvDMR1、Rasgrf1-DMR在鋅指蛋白 CTCF 的結(jié)合[87]。CTCF 鋅指蛋白具有廣泛的生物學(xué)功能構(gòu)域的邊界、啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等位置區(qū)域高度富集[88]。在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)制、X 染色體失活、調(diào)控染色體高級(jí)構(gòu)象等過(guò)程中具有重要的表觀(guān)遺經(jīng)典的 IGF2/H19 內(nèi)以等位特異性結(jié)合于 H19-ICR 上，使 IGF2 和 H1和印記狀態(tài)發(fā)生變化[89,90]。究者提出串聯(lián)重復(fù)序列可能調(diào)控差異甲基化區(qū)，這也是 DMR 區(qū)域的一因結(jié)構(gòu)特征，串聯(lián)重復(fù)序列對(duì)區(qū)間內(nèi)基因印記的維持和表達(dá)也起到一。MEG8-DMR 基因組結(jié)構(gòu)圖如圖 1-2 所示（UCSC Genome Browseb. 2009 (GRCh37/hg19) Assembly）。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡衛(wèi);吳勝蘭;王曠靖;張良鵬;潘茲書(shū);湯紹輝;;抑制IGF2基因的siRNA表達(dá)載體對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用[J];中國(guó)藥房;2015年22期

2 鄭武;谷峰;;CRISPR/Cas9的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進(jìn)展[J];遺傳;2015年10期

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 崔巍;miR-1188在小鼠胚胎發(fā)育和肝癌細(xì)胞中的功能研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2703035