【摘要】：目的:胃癌是全球發(fā)生率排第四位的癌癥,也是全球癌癥中引起死亡的第二大原因。為了降低胃癌的死亡率,亟需解決的問(wèn)題之一是發(fā)現(xiàn)新的早期胃癌特異性的標(biāo)志物,實(shí)現(xiàn)早期胃癌的診斷,達(dá)到早期手術(shù)治療的目的,從根本上解決胃癌死亡率高的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶4(Peroxiredoxin 4,PRDX4)具有早期胃癌標(biāo)志物的潛能。本研究的目的為:通過(guò)建立惡性轉(zhuǎn)化模型及轉(zhuǎn)化細(xì)胞過(guò)表達(dá)等方法,研究PRDX4在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的作用,揭示PRDX4通過(guò)減少轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,使細(xì)胞處在利于生長(zhǎng)增殖的微環(huán)境中,從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,即促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的作用。方法及結(jié)果:1、GES-1轉(zhuǎn)化模型的建立、轉(zhuǎn)化細(xì)胞腫瘤相關(guān)細(xì)胞功能指標(biāo)的檢測(cè)(1)建立惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞體系:利用N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-vitro-Nnitrosoguanidine,MNNG)對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1分別進(jìn)行0h、4h、8h、12h、16h、20h及24h的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后,培養(yǎng)24h。(2)觀察、分析GES-1細(xì)胞形態(tài)的變化:發(fā)現(xiàn)隨著MNNG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)由梭形、緊密排列的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形、不規(guī)則形、疊層生長(zhǎng)的細(xì)胞,證實(shí)GES-1轉(zhuǎn)化模型建立成功。(3)腫瘤相關(guān)細(xì)胞功能指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果:通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遷移能力、克隆形成能力及增殖能力隨著MNNG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)均逐漸增長(zhǎng),其中增殖能力最強(qiáng)的細(xì)胞為MTC-16;說(shuō)明隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),受試細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度逐漸增加。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,誘導(dǎo)至16h時(shí)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(Malignant Transformed Cell,MTC)已基本完成轉(zhuǎn)化,因此選擇MTC-16細(xì)胞為后續(xù)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞。2、不同誘導(dǎo)時(shí)間轉(zhuǎn)化細(xì)胞中ROS含量的檢測(cè),證實(shí)ROS促進(jìn)胃癌的發(fā)生利用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)誘導(dǎo)不同時(shí)間的細(xì)胞ROS含量,對(duì)比相同培養(yǎng)時(shí)間的GES-1細(xì)胞ROS含量結(jié)果顯示:隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)誘導(dǎo)0-12h時(shí),轉(zhuǎn)化細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸上升,當(dāng)誘導(dǎo)至12h-16h時(shí),轉(zhuǎn)化細(xì)胞的熒光強(qiáng)度升高至51092.92?99.54,達(dá)到最高;當(dāng)誘導(dǎo)至16h-24h時(shí),轉(zhuǎn)化細(xì)胞的熒光強(qiáng)度略有下降,分別為49652.14?429.15和47558.16?956.53,且不同誘導(dǎo)時(shí)間的各組轉(zhuǎn)化細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值均顯著高于GES-1細(xì)胞(42231.99?1064.91)。結(jié)果表明,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)ROS能夠促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程,當(dāng)細(xì)胞基本轉(zhuǎn)化后(誘導(dǎo)16h以后),隨著轉(zhuǎn)化程度進(jìn)一步增加,ROS含量逐漸下降,避免轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖提供一個(gè)良好的微環(huán)境。3、誘導(dǎo)不同時(shí)間細(xì)胞中PRDX4含量的檢測(cè),證實(shí)PRDX4促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的作用利用RT-PCR、Western Blot及ELISA方法檢測(cè)各受試細(xì)胞中PRDX4 m RNA及蛋白的表達(dá)量,結(jié)果顯示,誘導(dǎo)0-12h時(shí),PRDX4含量并無(wú)較大變化(GES-1細(xì)胞中為2.70?0.47ng/m L);誘導(dǎo)12h-16h時(shí),細(xì)胞中PRDX4表達(dá)量升高達(dá)到3.51?0.08ng/m L;誘導(dǎo)16h-24h時(shí),細(xì)胞中的PRDX4含量逐漸下降。該結(jié)果表明,PRDX4在0-12h時(shí)未及時(shí)清除細(xì)胞中的ROS,成為導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS急劇升高的原因之一,從而間接的促進(jìn)了細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,即促進(jìn)了胃癌的發(fā)生過(guò)程;誘導(dǎo)16h-24h時(shí),PRDX4含量升高,清除了細(xì)胞中的ROS,使得細(xì)胞處于利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的微環(huán)境中,從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,即促進(jìn)了胃癌的發(fā)展過(guò)程。4、PRDX4過(guò)表達(dá)的MTC-16細(xì)胞體系的建立,驗(yàn)證PRDX4促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用(1)PRDX4過(guò)表達(dá)的MTC-16細(xì)胞體系的建立:利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法,將重組構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體GV230-PRDX4轉(zhuǎn)染到MTC-16細(xì)胞中,通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功的基礎(chǔ)上,利用Western Blot法驗(yàn)證PRDX4過(guò)表達(dá)體系中的PRDX4蛋白含量,證實(shí)PRDX4過(guò)表達(dá)體系建立成功。(2)腫瘤相關(guān)細(xì)胞功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:MTC-16-GV230-PRDX4組的遷移能力、克隆形成能力及增殖能力明顯高于MTC-16組及GES-1組,證實(shí)PRDX4能夠促進(jìn)完成轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,轉(zhuǎn)化程度進(jìn)一步加深,即促進(jìn)胃癌的發(fā)展過(guò)程。5、PRDX4過(guò)表達(dá)的MTC-16細(xì)胞體系中ROS含量及PRDX4蛋白含量的檢測(cè),驗(yàn)證PRDX4在細(xì)胞中促癌作用的機(jī)制(1)ELISA檢測(cè)GES-1、MTC-16、MTC-16-GV230及MTC-16-PRDX4細(xì)胞中PRDX4蛋白含量,結(jié)果顯示:MTC-16-PRDX4細(xì)胞中PRDX4蛋白濃度為3.75?0.08ng/m L,顯著高于GES-1(2.20?0.12ng/m L)、MTC-16(3.14?0.06ng/m L)和MTC-16-GV230(3.05?0.08ng/m L)細(xì)胞。(2)利用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)GES-1、MTC-16、MTC-16-GV230及MTC-16-PRDX4細(xì)胞中ROS的含量,結(jié)果表明:MTC-16-PRDX4組中ROS含量為(45271.78?1736.2)顯著低于只轉(zhuǎn)染了空載體的早期胃癌模型細(xì)胞(51092.92?810.99),進(jìn)一步證實(shí)PRDX4通過(guò)清除ROS,使得細(xì)胞處在利于生長(zhǎng)增殖的微環(huán)境中,防止細(xì)胞凋亡,從而起到促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的作用。結(jié)論:1、隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng),轉(zhuǎn)化細(xì)胞的各項(xiàng)腫瘤相關(guān)細(xì)胞功能指標(biāo)(遷移能力、克隆形成能力及增殖能力)均有升高,誘導(dǎo)16h的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(MTC-16)已基本完成轉(zhuǎn)化。2、PRDX4在細(xì)胞初步轉(zhuǎn)化階段,未能及時(shí)清除ROS,從而間接促進(jìn)了胃癌的發(fā)生;PRDX4在細(xì)胞基本完成轉(zhuǎn)化后,通過(guò)清除轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的ROS,防止細(xì)胞由于ROS水平過(guò)高發(fā)生凋亡,使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞處于利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的微環(huán)境中,從而促進(jìn)胃癌的發(fā)展。
【圖文】：

圖 1-1 PRDX4 十聚體晶體結(jié)構(gòu)模型[38]Figure1-1 PRDX4 decamer crystal structure model[38]的國(guó)內(nèi)外研究中，，多數(shù)研究者已經(jīng)探究了 PRDX4 與其他出 PRDX4 在各類(lèi)腫瘤中多數(shù)為促癌作用（表 1-1）。

細(xì)胞中ROS的平衡[53]
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2703015