發(fā)布時間：2020-06-07 14:34

【摘要】：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見惡性腫瘤,發(fā)病率居世界第六,腫瘤相關死亡率居世界第三。據(jù)估計,全世界每年新診斷病例約五十萬人,統(tǒng)計顯示,發(fā)展中國家患病率較發(fā)達國家更高。早期肝細胞癌的治療方法有外科手術切除、經皮肝穿刺消融術和肝移植等。然而,對于進展期肝細胞癌,治療方法有限,且五年生存率極低。肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個非常復雜的過程,與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡及血管生成有關,涉及許多分子變化及信號通路,越來越多的證據(jù)表明,基因的異常表達或突變與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展及預后有關,包括癌基因(如CCND1、EGFR、c-myc和Ras等)以及抑癌基因(如p53、GSTP1、p16、RIZ1等)突變。腫瘤轉移和復發(fā)是HCC預后不良的主要原因,但是HCC的發(fā)生及轉移的具體機制仍未明確,因此探索其預后相關分子標記具有十分重要的意義,亦有助于為臨床治療提供更多方法。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一種病理狀態(tài),指因外環(huán)境改變,抑制維持上皮細胞形態(tài)的基因,上調表達肌成纖維細胞的基因,細胞喪失原有的上皮特征,從而轉變?yōu)殚g充質表型。在這個過程中,上皮標記減少,細胞間黏附作用下降;并出現(xiàn)了間充質標記,從而具備了遷移特性以及分泌功能。腫瘤細胞的EMT是腫瘤進展的主要機制之一。Twist屬于原始螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉錄因子家族,是與胚胎發(fā)育和腫瘤轉移相關的轉分化程序EMT的關鍵誘導劑之一,在調節(jié)EMT過程中起著舉足輕重的作用。從機制上講,Twist與E-box的結合可以通過轉錄抑制E-cadherin的表達,從而破壞細胞間粘附并誘導單個癌細胞從原發(fā)部位播散,進一步導致間充質標志物的激活和隨后誘導的細胞侵襲。XBP1(X-Box Binding Protein 1)是一種參與內質網(endoplasmic reticulum,ER)應激反應的分子,能夠使細胞在不利條件下存活。XBP1被非常規(guī)的剪接機制激活,具有兩種形式:剪接型XBP1s和非剪接型XBP1u,XBP1s由XBP1u經剪切后形成。XBP1u非常不穩(wěn)定,而XBP1s的半衰期較長,轉錄活性遠高于前者。已經發(fā)現(xiàn)XBP1蛋白在腫瘤細胞中異常高表達,但XBP1在HCC進展中的作用尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)HCC細胞系和組織樣本中XBP1s的表達高于對照細胞和組織樣本,臨床病理分析表明XBP1s的表達與遠處轉移和預后不良密切相關,體內和體外實驗也證實XBP1s的過表達促進了HCC細胞中的EMT和轉移,XBP1s的沉默減弱了細胞遷移和體外EMT表型的發(fā)展,通過進一步研究發(fā)現(xiàn),在HCC細胞中,XBP1s增強了Twist和Snail的表達,導致促進細胞粘附作用的E-cadherin的表達減少,闡明HCC細胞中XBP1s促進EMT的分子機制,證實XBP1s可以介導Twist的表達。綜上所述,這項研究揭示了一個新的XBP1s/Twist/Snail通路,可以介導EMT在HCC細胞中的表達及HCC的侵襲轉移。本課題分為四部分,研究了XBP1s在HCC細胞系與HCC組織中的表達情況,及其表達水平與HCC的預后之間的關系,探討了該基因在促進HCC的侵襲和轉移中的作用及具體機制,并提出下一步研究的方向。第一部分XBP1s在HCC組織和細胞系中的表達研究目的:研究XBP1s在HCC細胞系和正常肝細胞之間表達的差異,進一步研究XBP1s在HCC組織及癌旁組織中的表達及其與預后的關系。研究方法:1.采用免疫印跡分析、免疫熒光分析及qRT-PCR分析XBP1s在正常肝細胞系(QZG)和四種HCC細胞系中的表達;2.采用免疫印跡分析、免疫組化及qRT-PCR分析HCC患者癌組織及癌旁組織中的XBP1s表達水平。結果:1.免疫印跡分析及qRT-PCR研究表明,所有四種人類HCC細胞系中XBP1s的表達顯著高于QZG細胞(p0.01);免疫熒光分析顯示,與QZG細胞相比,XBP1s在HepG2細胞中顯著增加,并且XBP1s的染色模式主要位于肝細胞的細胞核中;2.免疫印跡分析及qRT-PCR研究證實,HCC組織中XBP1s的表達顯著高于癌旁組織(p0.05);免疫組織化學顯示,XBP1s主要位于肝細胞核內,XBP1s在HCC組織中的陽性表達率(79/103例,76.7%)顯著高于癌旁組織(20/103例,19.4%)(p0.05),XBP1s的過度表達與腫瘤大小(p=0.028)、肝內轉移(p=0.003)和遠處轉移(p=0.039)密切相關,但與性別、年齡、甲胎蛋白、HBV感染無顯著相關性。結論:XBP1s在HCC細胞中的表達量明顯高于正常肝細胞系;XBP1s在臨床HCC組織中的表達增加,且與遠處轉移有關。第二部分XBP1s促進HCC細胞的侵襲和轉移研究目的:研究XBP1s在HCC細胞的侵襲和轉移中的作用。研究方法:1.采用基質膠侵襲實驗測定XBP1s轉染的HCC細胞SMMC-7721和HepG2的侵襲能力;2.通過細胞劃痕實驗,比較HepG2/XBP1s和HepG2/GFP細胞之間的細胞遷移率,分析XBP1s轉染的HCC細胞的遷移能力;3.裸鼠尾靜脈注射XBP1s-HepG2細胞,用空載體轉染細胞作為對照,進行裸鼠體內腫瘤的轉移測定。結果:1.基質膠侵襲實驗顯示,與空載體轉染的細胞相比,XBP1s轉染的HCC細胞的侵襲能力顯著增加(p0.05);2.細胞劃痕實驗顯示,XBP1s的過表達增加HCC細胞遷移能力(p0.05);3.裸鼠的轉移實驗顯示,與對照組相比,注射XBP1s-HepG2細胞的裸鼠在肺中檢測到的微轉移病灶數(shù)目顯著增多(p0.05)。結論:XBP1s可增強HCC的侵襲和轉移能力。第三部分XBP1s促進HCC細胞的EMT研究目的:研究XBP1s與HCC細胞EMT的關系。研究方法:1.采用免疫印跡法分析XBP1s、上皮標記(E-cadherin,γ-catenin)和間充質標記(Vimentin)在轉染XBP1s的HepG2細胞中的表達;2.采用免疫熒光染色,觀察XBP1s的上調與HepG2細胞中E-cadherin,γ-catenin和Snail的表達之間的關系;3.采用免疫印跡法檢測HCC組織樣本中XBP1s、E-cadherin和Vimentin的表達。結果:1.免疫印跡結果顯示,XBP1s過表達的細胞中間充質標記Vimentin的表達增加,而表皮細胞標志物E-cadherin和γ-catenin降低(p0.05);2.免疫熒光結果顯示,與對照細胞相比,XBP1s過表達的細胞中,間充質標記Snail的表達明顯增加,而表皮細胞標志物E-cadherin和γ-catenin降低(p0.05);3.線性分析顯示,在HCC組織中,XBP1s的表達與Vimentin呈正相關(p0.001),與E-cadherin表達呈負相關(p0.001);進一步分析XBP1s的表達和表皮-間充質標志物的關系,在XBP1s高表達的HCC樣本中,Vimentin的高表達和E-cadherin的低表達分別為66.7%和64.5%,而在XBP1s低表達的HCC樣本中,Vimentin的高表達和E-cadherin的低表達僅為11.1%和18.2%,兩組結果具有顯著性差異(p0.05)。結論:XBP1s可促進HCC細胞的EMT。第四部分XBP1s通過Twist/Snail途徑調控HCC細胞的EMT研究目的:研究XBP1s可否激活Twist/Snail通路,并進一步調控HCC細胞的EMT。研究方法:1.采用免疫熒光染色研究XBP1s在HepG2細胞中是否上調Twist表達;2.采用免疫印跡法進一步明確XBP1s是否誘導Twist及其下游基因表達;3.采用Twist啟動子螢光素酶報告基因法分析XBP1s誘導的Twist轉錄激活;4.采用免疫印跡法進一步研究XBP1s是否通過Twist/Snail通路參與HCC細胞的EMT。結果:1.免疫熒光染色結果顯示,與對照組相比,XBP1s轉染的HepG2細胞中Twist表達水平顯著增加;2.免疫印跡結果顯示,與相應的對照組相比,XBP1s轉染的HepG2細胞中,XBP1s表達顯著增加,同時Twist和Snail顯著增加,而E-cadherin表達顯著降低;而XBP1s-siRNA轉染的HepG2細胞抑制Twist和Snail表達,同時上調E-cadherin表達;3.螢光素酶報告結果顯示,與Twist野生型啟動子載體相比,(-14至-20)突變型載體轉染的HepG2細胞中的熒光素酶活性顯著降低(p0.01);4.免疫印跡結果顯示,Twist siRNA可有效抑制Twist的表達,Snail siRNA可有效抑制Snail蛋白的表達,并能部分逆轉XBP1s誘導的EMT表型。結論:在HCC組織和肝細胞中,XBP1s通過XBP1s/Twist/Snail依賴途徑誘導HCC細胞EMT,并促進HCC的侵襲和轉移。
【圖文】：

BP1s 在正常肝細胞系（QZG）和四種 HCC 細胞系BP1s 主要表達于 HCC 細胞核析發(fā)現(xiàn)，XBP1s 在 HepG2 細胞中的表達主要定位于色劑 DAPI 融合，發(fā)現(xiàn) XBP1s 在 HepG2 細胞核中的ZG 中的表達（圖 2）。

）XBP1s 主要表達于 HCC 細胞核分析發(fā)現(xiàn)，XBP1s 在 HepG2 細胞中的表達主要定位于細顯色劑 DAPI 融合，發(fā)現(xiàn) XBP1s 在 HepG2 細胞核中的表 QZG 中的表達（圖 2）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 危志強;涂衛(wèi)平;房向東;;促腎小管上皮細胞轉分化誘導劑的研究進展[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2012年02期

2 張霞麗;萬福生;;X-盒結合蛋白1的生理及病理生理學作用[J];基礎醫(yī)學與臨床;2011年11期

3 林建煒;劉平;向廷秀;李祥柱;趙文君;郭風勁;;轉錄因子XBP1S對人肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響[J];腫瘤;2011年01期

相關碩士學位論文 前1條

1 鄭永;XBP1s在炎癥誘導腹膜纖維化形成中的作用[D];第四軍醫(yī)大學;2014年

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本文編號：2701565