【摘要】：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見惡性腫瘤,發(fā)病率居世界第六,腫瘤相關(guān)死亡率居世界第三。據(jù)估計(jì),全世界每年新診斷病例約五十萬人,統(tǒng)計(jì)顯示,發(fā)展中國家患病率較發(fā)達(dá)國家更高。早期肝細(xì)胞癌的治療方法有外科手術(shù)切除、經(jīng)皮肝穿刺消融術(shù)和肝移植等。然而,對于進(jìn)展期肝細(xì)胞癌,治療方法有限,且五年生存率極低。肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及血管生成有關(guān),涉及許多分子變化及信號通路,越來越多的證據(jù)表明,基因的異常表達(dá)或突變與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān),包括癌基因(如CCND1、EGFR、c-myc和Ras等)以及抑癌基因(如p53、GSTP1、p16、RIZ1等)突變。腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是HCC預(yù)后不良的主要原因,但是HCC的發(fā)生及轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍未明確,因此探索其預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)記具有十分重要的意義,亦有助于為臨床治療提供更多方法。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一種病理狀態(tài),指因外環(huán)境改變,抑制維持上皮細(xì)胞形態(tài)的基因,上調(diào)表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的基因,細(xì)胞喪失原有的上皮特征,從而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型。在這個(gè)過程中,上皮標(biāo)記減少,細(xì)胞間黏附作用下降;并出現(xiàn)了間充質(zhì)標(biāo)記,從而具備了遷移特性以及分泌功能。腫瘤細(xì)胞的EMT是腫瘤進(jìn)展的主要機(jī)制之一。Twist屬于原始螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族,是與胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)分化程序EMT的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑之一,在調(diào)節(jié)EMT過程中起著舉足輕重的作用。從機(jī)制上講,Twist與E-box的結(jié)合可以通過轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達(dá),從而破壞細(xì)胞間粘附并誘導(dǎo)單個(gè)癌細(xì)胞從原發(fā)部位播散,進(jìn)一步導(dǎo)致間充質(zhì)標(biāo)志物的激活和隨后誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲。XBP1(X-Box Binding Protein 1)是一種參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)應(yīng)激反應(yīng)的分子,能夠使細(xì)胞在不利條件下存活。XBP1被非常規(guī)的剪接機(jī)制激活,具有兩種形式:剪接型XBP1s和非剪接型XBP1u,XBP1s由XBP1u經(jīng)剪切后形成。XBP1u非常不穩(wěn)定,而XBP1s的半衰期較長,轉(zhuǎn)錄活性遠(yuǎn)高于前者。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)XBP1蛋白在腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá),但XBP1在HCC進(jìn)展中的作用尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞系和組織樣本中XBP1s的表達(dá)高于對照細(xì)胞和組織樣本,臨床病理分析表明XBP1s的表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān),體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)XBP1s的過表達(dá)促進(jìn)了HCC細(xì)胞中的EMT和轉(zhuǎn)移,XBP1s的沉默減弱了細(xì)胞遷移和體外EMT表型的發(fā)展,通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在HCC細(xì)胞中,XBP1s增強(qiáng)了Twist和Snail的表達(dá),導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞粘附作用的E-cadherin的表達(dá)減少,闡明HCC細(xì)胞中XBP1s促進(jìn)EMT的分子機(jī)制,證實(shí)XBP1s可以介導(dǎo)Twist的表達(dá)。綜上所述,這項(xiàng)研究揭示了一個(gè)新的XBP1s/Twist/Snail通路,可以介導(dǎo)EMT在HCC細(xì)胞中的表達(dá)及HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。本課題分為四部分,研究了XBP1s在HCC細(xì)胞系與HCC組織中的表達(dá)情況,及其表達(dá)水平與HCC的預(yù)后之間的關(guān)系,探討了該基因在促進(jìn)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及具體機(jī)制,并提出下一步研究的方向。第一部分XBP1s在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)研究目的:研究XBP1s在HCC細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞之間表達(dá)的差異,進(jìn)一步研究XBP1s在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。研究方法:1.采用免疫印跡分析、免疫熒光分析及qRT-PCR分析XBP1s在正常肝細(xì)胞系(QZG)和四種HCC細(xì)胞系中的表達(dá);2.采用免疫印跡分析、免疫組化及qRT-PCR分析HCC患者癌組織及癌旁組織中的XBP1s表達(dá)水平。結(jié)果:1.免疫印跡分析及qRT-PCR研究表明,所有四種人類HCC細(xì)胞系中XBP1s的表達(dá)顯著高于QZG細(xì)胞(p0.01);免疫熒光分析顯示,與QZG細(xì)胞相比,XBP1s在HepG2細(xì)胞中顯著增加,并且XBP1s的染色模式主要位于肝細(xì)胞的細(xì)胞核中;2.免疫印跡分析及qRT-PCR研究證實(shí),HCC組織中XBP1s的表達(dá)顯著高于癌旁組織(p0.05);免疫組織化學(xué)顯示,XBP1s主要位于肝細(xì)胞核內(nèi),XBP1s在HCC組織中的陽性表達(dá)率(79/103例,76.7%)顯著高于癌旁組織(20/103例,19.4%)(p0.05),XBP1s的過度表達(dá)與腫瘤大小(p=0.028)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(p=0.003)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p=0.039)密切相關(guān),但與性別、年齡、甲胎蛋白、HBV感染無顯著相關(guān)性。結(jié)論:XBP1s在HCC細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞系;XBP1s在臨床HCC組織中的表達(dá)增加,且與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。第二部分XBP1s促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移研究目的:研究XBP1s在HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。研究方法:1.采用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)測定XBP1s轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞SMMC-7721和HepG2的侵襲能力;2.通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),比較HepG2/XBP1s和HepG2/GFP細(xì)胞之間的細(xì)胞遷移率,分析XBP1s轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞的遷移能力;3.裸鼠尾靜脈注射XBP1s-HepG2細(xì)胞,用空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照,進(jìn)行裸鼠體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移測定。結(jié)果:1.基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,與空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,XBP1s轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞的侵襲能力顯著增加(p0.05);2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,XBP1s的過表達(dá)增加HCC細(xì)胞遷移能力(p0.05);3.裸鼠的轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示,與對照組相比,注射XBP1s-HepG2細(xì)胞的裸鼠在肺中檢測到的微轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目顯著增多(p0.05)。結(jié)論:XBP1s可增強(qiáng)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。第三部分XBP1s促進(jìn)HCC細(xì)胞的EMT研究目的:研究XBP1s與HCC細(xì)胞EMT的關(guān)系。研究方法:1.采用免疫印跡法分析XBP1s、上皮標(biāo)記(E-cadherin,γ-catenin)和間充質(zhì)標(biāo)記(Vimentin)在轉(zhuǎn)染XBP1s的HepG2細(xì)胞中的表達(dá);2.采用免疫熒光染色,觀察XBP1s的上調(diào)與HepG2細(xì)胞中E-cadherin,γ-catenin和Snail的表達(dá)之間的關(guān)系;3.采用免疫印跡法檢測HCC組織樣本中XBP1s、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)。結(jié)果:1.免疫印跡結(jié)果顯示,XBP1s過表達(dá)的細(xì)胞中間充質(zhì)標(biāo)記Vimentin的表達(dá)增加,而表皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和γ-catenin降低(p0.05);2.免疫熒光結(jié)果顯示,與對照細(xì)胞相比,XBP1s過表達(dá)的細(xì)胞中,間充質(zhì)標(biāo)記Snail的表達(dá)明顯增加,而表皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和γ-catenin降低(p0.05);3.線性分析顯示,在HCC組織中,XBP1s的表達(dá)與Vimentin呈正相關(guān)(p0.001),與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(p0.001);進(jìn)一步分析XBP1s的表達(dá)和表皮-間充質(zhì)標(biāo)志物的關(guān)系,在XBP1s高表達(dá)的HCC樣本中,Vimentin的高表達(dá)和E-cadherin的低表達(dá)分別為66.7%和64.5%,而在XBP1s低表達(dá)的HCC樣本中,Vimentin的高表達(dá)和E-cadherin的低表達(dá)僅為11.1%和18.2%,兩組結(jié)果具有顯著性差異(p0.05)。結(jié)論:XBP1s可促進(jìn)HCC細(xì)胞的EMT。第四部分XBP1s通過Twist/Snail途徑調(diào)控HCC細(xì)胞的EMT研究目的:研究XBP1s可否激活Twist/Snail通路,并進(jìn)一步調(diào)控HCC細(xì)胞的EMT。研究方法:1.采用免疫熒光染色研究XBP1s在HepG2細(xì)胞中是否上調(diào)Twist表達(dá);2.采用免疫印跡法進(jìn)一步明確XBP1s是否誘導(dǎo)Twist及其下游基因表達(dá);3.采用Twist啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因法分析XBP1s誘導(dǎo)的Twist轉(zhuǎn)錄激活;4.采用免疫印跡法進(jìn)一步研究XBP1s是否通過Twist/Snail通路參與HCC細(xì)胞的EMT。結(jié)果:1.免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對照組相比,XBP1s轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中Twist表達(dá)水平顯著增加;2.免疫印跡結(jié)果顯示,與相應(yīng)的對照組相比,XBP1s轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中,XBP1s表達(dá)顯著增加,同時(shí)Twist和Snail顯著增加,而E-cadherin表達(dá)顯著降低;而XBP1s-siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞抑制Twist和Snail表達(dá),同時(shí)上調(diào)E-cadherin表達(dá);3.螢光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,與Twist野生型啟動(dòng)子載體相比,(-14至-20)突變型載體轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中的熒光素酶活性顯著降低(p0.01);4.免疫印跡結(jié)果顯示,Twist siRNA可有效抑制Twist的表達(dá),Snail siRNA可有效抑制Snail蛋白的表達(dá),并能部分逆轉(zhuǎn)XBP1s誘導(dǎo)的EMT表型。結(jié)論:在HCC組織和肝細(xì)胞中,XBP1s通過XBP1s/Twist/Snail依賴途徑誘導(dǎo)HCC細(xì)胞EMT,并促進(jìn)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移。
【圖文】：

BP1s 在正常肝細(xì)胞系（QZG）和四種 HCC 細(xì)胞系BP1s 主要表達(dá)于 HCC 細(xì)胞核析發(fā)現(xiàn)，XBP1s 在 HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)主要定位于色劑 DAPI 融合，發(fā)現(xiàn) XBP1s 在 HepG2 細(xì)胞核中的ZG 中的表達(dá)（圖 2）。

）XBP1s 主要表達(dá)于 HCC 細(xì)胞核分析發(fā)現(xiàn)，XBP1s 在 HepG2 細(xì)胞中的表達(dá)主要定位于細(xì)顯色劑 DAPI 融合，發(fā)現(xiàn) XBP1s 在 HepG2 細(xì)胞核中的表 QZG 中的表達(dá)（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2701565