【摘要】：癌癥是威脅人類健康的重大疾病,世界衛(wèi)生組織下屬的官方癌癥研究機構負責統(tǒng)計了 2014年最新的世界癌癥病例,預計每年都會有1410萬人發(fā)展成為癌癥患者,而且癌癥尤其是在發(fā)展中國家具有很高的致死率。其中,白血病是一種發(fā)病率很高,危害性極大的造血干細胞惡性克隆性疾病,白血病的致病病因主要有病毒感染、化學因素、輻射誘導、染色體畸變等因素。目前,白血病的治療手段主要有化學治療、靶向治療、免疫治療、干細胞移植等�，F(xiàn)如今臨床上用于治療白血病的化療藥物主要以促進細胞分化為主,但是隨著用藥時間延長以及用藥量的增加,白血病細胞對化療藥物產生抗藥性的幾率也在增加,因此尋找新的化療藥物對白血病的治療具有重要意義。許多傳統(tǒng)中藥被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗腫瘤作用,漢防己甲素是一種從防己科植物根部提取的生物堿,近年來有研究表明漢防己甲素具有良好的抗腫瘤作用。本研究主要對漢防己甲素在體外、體內抗白血病的作用以及對其分子機制做了進一步研究。誘導細胞分化是化學藥物治療白血病的重要機制,且大量研究表明藥物誘導分化與自噬相關。本研究發(fā)現(xiàn):2μM漢防己甲素作用于K562、THP-1以及AML病人細胞后能夠誘導細胞分化。瑞氏-姬姆薩染色、NBT還原實驗、流式檢測細胞表面CD14與CD11b表達、Western blot檢測CD14蛋白表達都檢測到細胞分化的發(fā)生。另一方面,研究表明漢防己甲素能夠誘導白血病細胞自噬發(fā)生,并且具有時間及濃度梯度依賴性。Western blot檢測自噬標志性蛋白LC3、吖啶橙熒光染料染自噬泡、GFP-LC3熒光點聚集實驗顯示漢防己甲素能夠誘導血癌細胞發(fā)生自噬,ptf-LC3雙熒光、LC3-II轉化法檢測到藥物處理后細胞中自噬流的產生。自噬早期抑制劑3-MA能夠抑制細胞自噬的發(fā)生進而抑制細胞分化,敲除自噬相關基因atg7后也阻斷了漢防己甲素誘導細胞分化的發(fā)生。以上實驗表明漢防己甲素誘導的細胞分化與自噬相關。細胞內的活性氧(Reaction oxygen species,ROS)是氧化應激反應中的重要信號分子,研究表明細胞內ROS水平變化是許多藥物誘導白血病細胞分化的重要機制。對漢防己甲素誘導白血病細胞分化的分子機制進行研究,結果顯示漢防己甲素能夠誘導白血病細胞內ROS的累積,并且ROS的累積能夠影響漢防己甲素誘導的細胞分化與細胞自噬,研究中發(fā)現(xiàn)使用NAC及Tiron清除ROS后能夠拯救其誘導的細胞分化以及自噬。c-myc是參與細胞命運決定的重要基因,有報道稱一些化療藥物可以通過抑制c-MYC表達來促進白血病細胞分化。在本研究中,通過對漢防己甲素誘導白血病細胞分化分子機制的研究發(fā)現(xiàn),2 μM漢防己甲素能夠抑制c-MYC表達,同時對c-myc的mRNA水平也具有一定的抑制作用,研究過程中通過外源過表達c-MYC能夠拯救漢防己甲素誘導的細胞分化,而且其小分子抑制劑與漢防己甲素具有協(xié)同誘導血癌細胞分化的作用。此外,研究檢測到c-MYC蛋白的變化可能位于細胞自噬的上游。為了研究漢防己甲素對正常造血細胞的作用,我們將受孕12.5天后的ICR小鼠的胚胎進行剝離,收集小鼠胚胎中的造血細胞,通過MTS、細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)2 μM漢防己甲素對正常造血細胞無殺傷作用,但檢測細胞自噬發(fā)現(xiàn)相同濃度的漢防己甲素能夠促進造血細胞自噬的發(fā)生,同時我們利用分離的人臍帶血造血細胞研究也發(fā)現(xiàn)了相同結果。在本研究中,除了一些體外的細胞實驗,我們利用THP-1 Vector、THP-1 c-MYC白血病細胞建立了裸鼠異種移植瘤模型,研究漢防己甲素在體內對白血病細胞分化的影響,以及檢測c-MYC是否參與其中。通過比較腫瘤大小、瘤體的重量,結果顯示漢防己甲素在動物體內也有很好抑制腫瘤作用的效果;通過分析灌胃后動物體重變化,發(fā)現(xiàn)25 mg/kg以及50 mg/kg的漢防己甲素對老鼠的毒性較低;免疫組化分析腫瘤中CD14和c-MYC蛋白表達,結果顯示在體內漢防己甲素能夠誘導血癌細胞發(fā)生分化,且與c-MYC蛋白表達緊密相關;利用MDA試劑盒檢測腫瘤內MDA水平的變化,能夠檢測到在動物體內漢防己甲素也能促進ROS的累積;通過weasterm blot以及免疫組化檢測LC3以及weastern blot檢測c-MYC蛋白表達也得到了與體外實驗相一致的結果。綜上所述,研究表明漢防己甲素可以通過抑制c-MYC表達以及促進細胞內ROS的累積誘導細胞分化與自噬的發(fā)生。因此,研究表明漢防己甲素能夠作為誘導白血病細胞分化以及自噬的誘導劑,在白血病治療中具有潛在的應用價值。
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隨著研究發(fā)展，越來越多的人們認識到白血病的分型以及預后均十分復雜，逡逑所以臨床上用于治療白血病的方法也有多種多樣，具體治療方法的制定需要結合逡逑病人自身情況，通過嚴格檢測篩選出最適合病人的治療方案。圖１．２比較詳細的逡逑顯示了白血病研究及治療的相關進程。逡逑２逡逑

１．１．４白血病分化治療逡逑細胞分化是機體的一種正常生理功能，，其中人體正常造血干細胞能夠向有功逡逑能的成熟血細胞分化。但是在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中，如圖１．３所示，正常造逡逑血干細胞不能夠進行終末分化，導致一些具有分化能力的細胞不斷增殖累積逡逑（Ｔｓｉｆｔｓｏｇｌｏｕ，邋Ｐａｐｐａｓ邋ｅｔａｌ＿邋２００３）�，F(xiàn)階段有研究表明，造血干細胞細胞分化受多種逡逑轉錄因子、生長因子以及細胞信號轉導通路等共同調節(jié)，如圖１．４所示，在生物逡逑體內各種細胞因子能夠調控造血干細胞分化為血液中存在的多種正常細胞（Ｒｏｂｂ逡逑２００７）。逡逑ＬＥＵＫＥＭＩＡ邐＾邐Ｌｅｕｋｅｍｉｃ逡逑？邋邐？邋？邐一邋Ｖ逡逑ｒ邐Ｍａｔｕｒｅ逡逑ＬＴ－ＨＳＣ邐ＳＴ－ＨＳＣ邐？＇一＂一逡逑個邐個邐？娭邋Ｂｌｏｏｄ逡逑１邐—邐１邋Ｂｌｏｃｋａｄｅ邋ｏｆ逡逑ＨＳＣｓ邐Ｕ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋Ｊ邐Ｃｅｌｌｓ逡逑ｉｎ邋ｅａｒｌｙ逡逑ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ逡逑圖１．３造血干細胞分化被抑制導致白血病的發(fā)生（Ｔｓｉｆｔｓｏｇｌｏｕ，邋Ｐａｐｐａｓ邋ｅｔａｌ．邋２００３）逡逑４逡逑
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 朱小蘭;許文林;呂旭晶;羅文娟;周磊磊;陳巧云;;漢防己甲素預防K562細胞獲得性耐藥機制的研究[J];中國實驗血液學雜志;2011年02期

2 王玨瓊;陳寶安;程堅;許文林;孫新臣;;5-溴漢防己甲素與漢防己甲素對K562/A02細胞多藥耐藥性逆轉作用的比較[J];癌癥;2008年05期

3 ;Potential role of tetrandrine in cancer therapy[J];Acta Pharmacologica Sinica;2002年12期

本文編號：2700714