【摘要】：研究背景及目的:三陰性乳腺癌作為乳腺癌分子分型中的一種,特點(diǎn)是雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長因子2均不發(fā)生表達(dá)。癌癥基因組圖譜揭示了三陰性乳腺癌這類腫瘤可能存在大量的拷貝數(shù)改變,p53突變,PI3K通路激活,以及DNA損傷修復(fù)和同源重組(HR)缺陷等。因此,傳統(tǒng)的化療方案在這部分分子分型的腫瘤中獲益不佳,至今為止三陰性乳腺癌的治療也依然沒有標(biāo)準(zhǔn)的治療方案,這些現(xiàn)狀急需針對(duì)三陰性乳腺癌的更有效的靶向治療方案的推出。Olaparib、PI3K抑制劑和卡鉑(CBP)均已被證實(shí)單獨(dú)應(yīng)用在三陰性乳腺癌中為安全和有效的。在臨床I期實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了BKM120和Olaparib可以聯(lián)合使用,且不存在藥物的互相作用,這種有效性在BRCA突變和BRCA未突變的患者中均觀察到了臨床獲益。因此,我們根據(jù)這三種藥物的藥理機(jī)制參考臨床使用方案,設(shè)計(jì)了三藥聯(lián)合的作用在三陰性乳腺癌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)。本研究的主要目的在于探究三藥聯(lián)合使用在TNBC細(xì)胞系中對(duì)細(xì)胞生長抑制的效果,并通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,并為未來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)提供有力的證據(jù)。研究方法:1.利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)方法對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞系CAL51、MDA-MB-231和激素受體陽性的細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞分別進(jìn)行Olaparib、CBP、BKM120三種藥物單藥或三藥聯(lián)合兩種方案處理后,得到其各自的IC50值,從而評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用,并使用Calcusyn2.0軟件計(jì)算三藥的聯(lián)合指數(shù)(combination index CI),判斷三種藥物聯(lián)合使用是否存在藥物的協(xié)同作用。2.利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別以單藥、雙藥、三藥多種給藥方案處理后,對(duì)于CAL51和MDA-MB-231的細(xì)胞克隆形成的抑制作用。3.利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別以單藥、雙藥或三藥處理多種藥物處理后,對(duì)于CAL51和MDA-MB-231的細(xì)胞周期的影響,以明確三藥聯(lián)合是否對(duì)細(xì)胞周期發(fā)生作用從而達(dá)到抑制細(xì)胞生長的作用。4.采用Western blotting技術(shù)檢測在Olaparib、CBP、BKM120三種藥物對(duì)分別以不同濃度單藥處理后,檢測CAL51和MDA-MB-231的細(xì)胞中H2AX、cleaved-PARP、PADPR、ATM、Chk1和Chk2蛋白的表達(dá),以推測其對(duì)于DNA損傷的作用。5.采用Western blotting技術(shù)檢測在Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別在單藥、雙藥或三藥不同方案處理后,對(duì)CAL51和MDA-MB-231的細(xì)胞檢測其H2AX、PADPR、53BP1、p27、p21和p-ATM等蛋白的表達(dá)情況,以推測使用三藥后對(duì)細(xì)胞的DNA損傷及DNA修復(fù)HR通路和NHEJ通路的影響。6.利用免疫熒光方法技術(shù)進(jìn)一步了解Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別在單藥、雙藥或三藥不同方案處理后對(duì)CAL51和MDA-MB-231的細(xì)胞的DNA損傷程度的影響,并進(jìn)一步研究三藥聯(lián)合使用對(duì)DNA修復(fù)的HR通路和NHEJ通路的活化情況的影響。研究結(jié)果:1.當(dāng)Olaparib單獨(dú)使用在CAL51和MDA-MB-231細(xì)胞系中,在CAL51細(xì)胞系中其IC50為44.12(μM),在MDA-MB-231細(xì)胞系中其IC50為95.07(μM),可見Olaparib單藥使用在非BRCA突變的三陰性乳腺癌細(xì)胞系中其細(xì)胞殺傷作用非常有限。當(dāng)Olaparib作用在激素受體陽性的MCF-7細(xì)胞系中,其IC50為2237μM,無明顯細(xì)胞生長抑制作用。2.Olaparib、CBP和BKM120三種藥物聯(lián)合使用后,聯(lián)合指數(shù)CI值在CAL51和MDA-MB-231中中均小于1.0,且大部分?jǐn)?shù)據(jù)0.8,這證明三藥具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。而在MCF-7細(xì)胞系中卻無類似協(xié)同作用出現(xiàn)。3.在細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)?shù)蜐舛仁褂肙laparib、CBP、BKM120三種藥物中的單藥或聯(lián)合使用雙藥時(shí),其抑制細(xì)胞生長的作用比較有限,而當(dāng)?shù)蜐舛热幝?lián)合使用時(shí)卻能夠有效抑制細(xì)胞克隆的形成。4.在細(xì)胞周期檢測中發(fā)現(xiàn),Olaparib、CBP、BKM120三藥聯(lián)合使用后,細(xì)胞周期阻滯作用明顯增強(qiáng),表現(xiàn)在CAL51細(xì)胞系中G2/M期細(xì)胞明顯增多(20.6%),MDA-MB-231細(xì)胞系中的S期細(xì)胞明顯增多(10.1%)。兩種細(xì)胞系在三藥作用后處于G0/G1期的細(xì)胞比例較對(duì)照組均明顯減少。而當(dāng)比較OLA+CBP雙藥組和三藥組時(shí),由于BKM120的加入,G1期細(xì)胞比例明顯增加。5.采用Western blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),Olaparib、CBP、BKM120單藥處理CAL51和MDA-MB-231兩個(gè)細(xì)胞系后,H2AX,p-CHK1和p-CHK2的表達(dá)均明顯增多,PADPR的表達(dá)均明顯降低,證明三種藥物處理后DNA損傷的相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增多,三藥均具有導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA損傷的作用,且隨藥物劑量的增加,DNA損傷更為明顯。6.在Olaparib、CBP、BKM120三藥聯(lián)合使用后,除了DNA損傷增加以外,NHEJ修復(fù)通路的蛋白53BP1,p53和p-ATM表達(dá)也明顯增加,進(jìn)而證明了三藥的聯(lián)合使用導(dǎo)致了NHEJ修復(fù)通路活化的增加。三藥組與OLA+CBP雙藥組相比,p27和p21表達(dá)明顯增加,反應(yīng)了BKM120的加入增加了對(duì)PI3K通路的抑制作用,激活了細(xì)胞周期的G1期阻滯。7.通過免疫熒光實(shí)驗(yàn),Olaparib、CBP、BKM120三藥聯(lián)合使用與對(duì)照組相比,γ-H2AX熒光表達(dá)明顯增加,說明三藥使用增加了細(xì)胞的DNA損傷,而導(dǎo)致代表了HR通路的DNA修復(fù)的RAD51和HR修復(fù)通路中的重要成分BRCA1的熒光表達(dá)較較雙藥組明顯降低,53BP1的表達(dá)卻明顯升高。從而證明雙鏈DNA損傷增加,但HR修復(fù)途徑被抑制,導(dǎo)致NHEJ修復(fù)途徑增多,可能造成DNA損傷修復(fù)的正確率下降,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。研究結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了Olaparib、CBP、BKM120三藥聯(lián)合使用的有效性。三藥聯(lián)合使用通過DNA損傷協(xié)同作用于三陰性乳腺癌細(xì)胞,抑制同源重組修復(fù)(HR)途徑,增加其非同源末端連接(NHEJ)通路進(jìn)行DNA修復(fù),從而導(dǎo)致DNA損傷增加、修復(fù)能力下降,最終增強(qiáng)其對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用。本研究為Olaparib聯(lián)合CBP和BKM120的治療應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

24A-1C Olaparib 單獨(dú)使用在三陰性乳腺癌細(xì)胞 CAL51 和 MDA-M殺傷作用非常有限。用 MTT 法測定三陰性乳腺癌細(xì)胞 MDA-ML51 細(xì)胞，以及 MCF-7（非三陰性乳腺癌細(xì)胞系）的半抑制濃度(A)OLA，(B)CBP，或(C)BKM120。OLA：Olaparib；CBP：卡P-BKM120；Cell inhibition(%)：細(xì)胞抑制率(%)；IC50，半抑制濃

C 為 CAL51、MDA-MB-231、MCF-7 三種細(xì)胞系使用三藥聯(lián)合應(yīng)用結(jié)果。結(jié)果為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算其平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*P<0.a代表單藥的敏感曲線顯示在圖 1A-C;b代表三藥聯(lián)合使用后的敏感 2A-C. BKM120：NVP-BKM120; CBP：卡鉑; IC50：半抑制濃度。e IC50(μM)Drug aloneaIC50(μM)Drug combinationbOlaparib CBP BKM120 Olaparib CBP BKM 44.1 1.2 4.8 3.3 0.8 0.6MB-231 95.1 16.5 11.1 12.5 3.1 2.5表格 1
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2699874