【摘要】：據(jù)我國(guó)癌癥死亡率調(diào)查報(bào)告顯示,近幾十年來,我國(guó)肺癌人群的死亡率顯著增加,肺癌已經(jīng)成為中國(guó)癌癥死亡率最高的惡性腫瘤。人體免疫狀態(tài)與腫瘤有著密切的關(guān)系,機(jī)體免疫狀態(tài)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)和條件。細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量95%來自線粒體,其在機(jī)體免疫細(xì)胞正常功能維持中擔(dān)任不可缺少的角色。目前肺癌的發(fā)生、發(fā)展與免疫細(xì)胞線粒體功能之間的關(guān)系尚缺少系統(tǒng)性研究的報(bào)道。我們提出外周血免疫細(xì)胞線粒體功能下降與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的假設(shè)。本文主要觀察外周血單個(gè)核細(xì)胞免疫功能與線粒體活性氧類(Reactive oxygen species,ROS)、膜電位及ATP(adenosine triphosphate)之間的關(guān)系。研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)方面(1)肺癌患者與正常人群外周血免疫細(xì)胞線粒體功能的變化;(2)苯并芘(benzo[a]pyrene,BaP)致雄性昆明小鼠肺癌模型的建立;(3)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的線粒體功能在BaP誘導(dǎo)肺癌發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律。本文主要獲得以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)肺癌患者與正常人群外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能的變化情況:本文對(duì)肺癌患者和正常人群臨床調(diào)查與研究中發(fā)現(xiàn),正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS含量為38.16±9.92,肺癌組為48.01±8.71,顯著高于正常對(duì)照組(P0.01)。正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體膜電位為2379.98±641.46,肺癌組為1310.64±210.24,與正常對(duì)照組相比,肺癌組的線粒體膜電位明顯降低(P0.01)。正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞ATP含量為9.30±3.98,肺癌組含量14.46±5.02,顯著低于正常對(duì)照組(P0.01)。隨后通過流式標(biāo)記檢測(cè)了外周血單個(gè)核細(xì)胞中T、B淋巴細(xì)胞的線粒體膜電位,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組外周血CD3~+CD19~-T細(xì)胞線粒體膜電位為1470.37±219.33,肺癌組為1016.73±238.17,顯著低于正常組(P0.01);正常對(duì)照組外周血CD3~-CD19~+B為2781.42±648.69,肺癌組為953.28±301.50,顯著低于正常對(duì)照組(P0.01),表明肺癌患者T、B淋巴細(xì)胞線粒體功能均顯著降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)各個(gè)年齡段腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS、線粒體膜電位及ATP含量均出現(xiàn)了顯著變化,并且不受性別差異的影響。由以上結(jié)果表明,與正常對(duì)照組相比,肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS含量顯著升高,線粒體膜電位及ATP合成降低。表明肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),線粒體功能降低。(2)BaP致小鼠肺癌模型建立:末次灌胃6周后BaP組小鼠的腫瘤數(shù)(0.13±0.33)和肺癌發(fā)病率(10.0%)與對(duì)照組的腫瘤數(shù)(0.10±0.31)和肺癌發(fā)病率(8.0%)相比并無差異(P0.05);而末次灌胃14周后BaP組小鼠的腫瘤數(shù)(0.72±1.01)和肺癌發(fā)病率(46.0%)與對(duì)照組的腫瘤數(shù)(0.26±0.64)和肺癌發(fā)病率(12.0%)相比均明顯增加(P0.05)。同時(shí),末次灌胃14周后BaP小鼠的腫瘤數(shù)和肺癌發(fā)病率與末次灌胃6周后相比顯著增加(P0.05)。以上結(jié)果表明,BaP可以誘導(dǎo)小鼠肺癌的發(fā)生,且隨著BaP誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)不斷升高。(3)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的線粒體功能在BaP所致肺癌發(fā)生中的變化情況:通過檢測(cè)BaP誘導(dǎo)小鼠肺癌發(fā)生之前和肺癌發(fā)生之后外周血單個(gè)核細(xì)胞的線粒體功能發(fā)現(xiàn):末次灌胃6周后處理的小鼠,對(duì)照組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS熒光值為145.67±32.74,BaP組為186.10±57.23,明顯高于對(duì)照組(P0.05)。對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體膜電位為1492.72±348.10,BaP組為1250.81±457.75,明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞ATP的值為13.46±3.55,BaP組為10.11±3.50,顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。進(jìn)一步對(duì)單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的T、B淋巴細(xì)胞進(jìn)行分群檢測(cè)發(fā)現(xiàn):對(duì)照組外周血CD3~+CD19~-T細(xì)胞線粒體膜電位為423.37±103.82,BaP組為336.65±87.57,顯著低于對(duì)照組(P0.01)。對(duì)照組CD3~-CD19~+B細(xì)胞線粒體膜電位為1785.60±493.54,BaP組為1372.78±334.73,顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。末次灌胃14周后對(duì)照組小鼠單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS熒光值為158.39±47.76,BaP組198.52±58.97,明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);同時(shí)對(duì)BaP組中未得腫瘤小鼠與發(fā)生肺癌的小鼠單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS熒光值進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):未得腫瘤小鼠的為176.82±78.68,肺癌小鼠的為217.40±80.43,高于未得腫瘤小鼠,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體膜電位值為1195.30±232.80,BaP組為953.95±232.57,顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);BaP組中未得腫瘤小鼠的單個(gè)核細(xì)胞膜電位為1008.92±217.54,肺癌小鼠為903.55±238.90,高于未得腫瘤小鼠,但不具有有計(jì)學(xué)差異(P0.05)。對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞ATP含量為16.65±5.73,BaP組為12.27±3.69,顯著低于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);BaP組中未得腫瘤小鼠的單個(gè)核細(xì)胞ATP值13.72±3.30,肺癌小鼠為9.82±3.16,ATP含量顯著低于正常組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組外周血CD3~+CD19~-T細(xì)胞線粒體膜電位為355.57±93.58,BaP組為312.35±86.86,明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);BaP組中未得腫瘤小鼠的B細(xì)胞線粒體膜電位為1210.99±312.10,肺癌小鼠為1041.23±231.17,明顯低于未得腫瘤小鼠,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。對(duì)照組外周血CD3~-CD19~+B細(xì)胞膜電位值為1501.82±535.31,BaP組為1122.42±283.06,與對(duì)照組相比,BaP組B淋巴細(xì)胞膜電位顯著降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);BaP組中正常組B細(xì)胞線粒體膜電位為1210.99±312.10,肺癌組為1041.23±231.17,明顯低于正常組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果表明:末次灌胃6周后即肺癌發(fā)生之前外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS含量升高、線粒體膜電位下降、ATP合成減少,繼而引起免疫細(xì)胞線粒體功能降低、免疫細(xì)胞能量合成下降。且這些變化一直持續(xù)至肺癌發(fā)生后。說明BaP誘發(fā)動(dòng)物肺癌出現(xiàn)之前就已經(jīng)導(dǎo)致其外周血免疫細(xì)胞線粒體功能下降。BaP致動(dòng)物肺癌除其本身致癌作用外,外周血免疫細(xì)胞線粒體功能下降也是主要原因之一。綜上肺癌患者與正常人群相比,免疫細(xì)胞線粒體功能降低、免疫細(xì)胞能量合成下降。同時(shí),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,末次灌胃6周后(肺癌發(fā)生前)和末次灌胃14周后(肺癌發(fā)生后)BaP組小鼠與正常組相比,免疫細(xì)胞的功能均有所下降,機(jī)體免疫功能的損傷可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。本研究為揭示肺癌的發(fā)生機(jī)制提供一個(gè)新的思路,并為肺癌的早期診斷及治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

漿后的全血細(xì)胞溶液用毛細(xì)吸管將此抗凝稀釋分離液試管中，使與分離液形成一界面，兩者℃）下于水平離心機(jī)中，2000r/min 離心 20mi后，可以看到管內(nèi)有明顯的階層，從上到下分層，顆粒白細(xì)胞和紅細(xì)胞層，如圖 2-1；吸管，將單個(gè)核細(xì)胞層慢慢吸出，移入另一 2m的 PBS 溶液，徹底混勻后在室溫下，3000r/mi的上層液體倒掉，淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞位于離心裂解液（并用加液槍吹打底部的白色物質(zhì)，使室溫條件下靜止 5min，調(diào)整至 3000r/min，離心后，將上清液棄掉，取 1ml PBS 于試管中，充分離心 5min，，沉淀即是 PBMC。

圖 2-2 不同組線粒體活性氧平均熒光強(qiáng)度（M1：細(xì)胞的本底熒光值利用陰性對(duì)照組“畫門”去除）ure 2-2 The average fluorescence intensity of reactive oxygen species in mitochondifferent groupse negative control group "painted" to remove the cell background fluorescence va對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體 ROS 含量為 38.16±9.921±8.71，顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01）（表 2-3，圖 2-3肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體 ROS 含量與正常對(duì)照（P<0.05，P<0.01）（表 2-4，圖 2-4）。不同性別組肺癌患核細(xì)胞線粒體 ROS 含量與正常對(duì)照組相比均增高（P<0肺癌組與男性肺癌組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表 2-5，圖 2
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2

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3 何e

本文編號(hào)：2699820