【摘要】：近年來的研究表明,環(huán)狀RNA廣泛存在于人體正常組織、癌組織、血清及血漿等。而且已有相關(guān)報道顯示它們在膀胱癌、胃癌及結(jié)腸癌等癌癥的進展中發(fā)揮了重要作用。然而,環(huán)狀RNA在肝細(xì)胞癌(簡稱為肝癌)中的作用尚不清楚。在本研究中,我們探索了環(huán)狀RNA在肝癌中的功能以及診斷價值。我們的研究由下面兩個部分組成。在本研究的第一部分,我們利用高通量測序檢測了五對肝癌及對應(yīng)的癌旁組織的環(huán)狀RNA的表達情況并以cSMARCA5(來自SMARCA5基因第15和第16外顯子的環(huán)狀RNA分子,其在CircBase數(shù)據(jù)庫的編號為hsa_circ_0001445)為代表探索了環(huán)狀RNA在肝癌中的功能。首先,通過環(huán)狀RNA測序,我們發(fā)現(xiàn)了4727個較高豐度(在肝癌或癌旁組織的平均RPM≥0.1)的環(huán)狀RNA。它們中的大多數(shù)來自外顯子,而且大多數(shù)長度低于1000個堿基。重要的是,我們在人類肝組織中發(fā)現(xiàn)了513個新的環(huán)狀RNA分子以及236個在肝癌癌旁差異表達的環(huán)狀RNA分子,其中,108個環(huán)狀RNA分子在肝癌組織中上調(diào),128個環(huán)狀RNA分子在肝癌組織中下調(diào)。通過實時定量PCR,瓊脂糖凝膠電泳以及Sanger測序,我們成功驗證了五個在肝癌組織中上調(diào)的環(huán)狀RNA(cDNAJC6,cGPC3,cME1,cPVT1和cSATB2)和五個在肝癌組織中下調(diào)的環(huán)狀RNA(cCYP2C8,cKCNN2,cLIFR,cPIK3R1和cSMARCA5)。其次,通過RNase R(一種5’→3’核酸外切酶,能特異性地消化線性RNA而保留環(huán)狀RNA)消化實驗,放線菌素D轉(zhuǎn)錄抑制實驗,熒光原位雜交(FISH,fluorescence in situ hybridization)以及實時定量PCR實驗等,我們證明了cSMARCA5是一種穩(wěn)定的、高豐度的,主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀RNA分子,并且在肝癌組織中的表達低于癌旁組織。第三,通過構(gòu)建野生型(從第14內(nèi)含子到第16內(nèi)含子全部克隆到過表達質(zhì)粒中)以及I14RC(reverse complementary sequences in intron 14,SMARCA5基因第14內(nèi)含子上的一段序列,與I16RC反向互補)和(或)I16RC(reverse complementary sequences in intron 16,SMARCA5基因第16內(nèi)含子上的一段序列,與I14RC反向互補)缺失型的cSMARCA5過表達質(zhì)粒,實時定量PCR,Northern blot,RNA干擾以及RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)等實驗,我們證明了I14RC和I16RC在cSMARCA5的生成過程中是必不可少的,而DHX9(DExH-Box Helicase 9,一種高豐度的細(xì)胞核內(nèi)RNA解螺旋酶)能夠通過結(jié)合I14RC和I16RC來抑制它們的配對,從而抑制cSMARCA5的形成。另外,DHX9的mRNA和蛋白在肝癌組織的表達高于癌旁組織,并且肝癌組織中DHX9的免疫組化評分與CSMARCA5的表達水平呈正相關(guān)。接著,在一個有163名肝癌患者的隊列中,我們也證實了cSMARCA5在肝癌組織的下調(diào)。我們進一步發(fā)現(xiàn)cSMARCA5在肝癌組織中的低表達與侵襲性特征顯著相關(guān),包括增加的腫瘤大小(5cm),較差的Edmondson分級,存在微血管侵犯,較晚的TNM及巴塞羅那臨床肝癌(BCLC)分期。cSMARCA5的下調(diào)表明HCC患者的總生存期(OS)和無復(fù)發(fā)生存期(RFS)較短。多因素分析表明cSMARCA5的下調(diào)是肝癌患者手術(shù)后OS和RFS的獨立危險因素。然后,我們利用cSMARCA5過表達質(zhì)粒在肝癌細(xì)胞系中成功地過表達了cSMARCA5,利用靶向其反向剪切位點的小干擾RNA(small interfering RNAs,siRNAs)在肝癌細(xì)胞系中成功地干擾了cSMARCA5的表達。CCK-8(Cell Counting Kit-8),細(xì)胞劃痕、Transwell、皮下荷瘤、腫瘤肝臟原位種植肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移等實驗表明過表達cSMARCA5能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、細(xì)胞劃痕和Transwell等實驗表明干擾cSMARCA5能促進肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。最后,通過miRanda軟件預(yù)測、AGO2抗體的RIP實驗、circRIP實驗、雙熒光素酶報告系統(tǒng)、生物素標(biāo)記的microRNA捕獲以及RNA熒光原位雜交實驗等,我們證明了cSMARCA5能結(jié)合miR-17-3p及miR-181b-5p。通過查閱文獻以及實驗驗證,我們發(fā)現(xiàn)過表達或干擾cSMARCA5之后,miR-17-3p和miR-181b-5p的共同靶基因TIMP3變化最明顯。因此,我們假設(shè)cSMARCA5主要是通過吸附miR-17-3p和miR-181b-5p來保護TIMP3不受降解,從而上調(diào)TIMP3,起到抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移的作用。為了驗證這個假設(shè),我們進行了一系列的實驗。首先,我們發(fā)現(xiàn)miR-17-3p和(或)miR-181b-5p對TIMP3的降解作用可以被cSMARCA5所阻斷。其次,CCK-8增殖實驗表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p對肝癌細(xì)胞增殖的促進作用可以被cSMARCA5所阻斷。而Transwell實驗表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進作用可以被cSMARCA5所阻斷。另外,TIMP3的mRNA水平在肝癌組織中的表達量低于癌旁,并且與cSMARCA5的表達量呈正相關(guān)關(guān)系。綜上所述,cSMARCA5(至少部分)通過miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移。綜上所述,環(huán)狀RNA cSMARCA5能抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移,是潛在的肝癌治療靶點。在本研究的第二部分,我們用環(huán)狀RNA芯片檢測了五例乙肝相關(guān)肝癌(簡稱肝癌)及五例慢性乙型肝炎(簡稱慢乙肝)患者的血漿。我們發(fā)現(xiàn)了371個差異表達的環(huán)狀RNA分子,其中326個在肝癌血漿中高于慢乙肝血漿,45個在肝癌血漿中低于慢乙肝血漿。將326個上調(diào)的環(huán)狀RNA與肝癌組織中檢測到的環(huán)狀RNA取交集后,我們獲得了10個候選環(huán)狀RNA分子。通過實時定量PCR,瓊脂糖凝膠電泳,Sanger測序,RNase R消化以及室溫孵育等實驗,我們成功鑒定出了其中的四個(hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_000775和hsa_circ_0139897),證明它們是環(huán)狀的并穩(wěn)定存在于血漿和肝組織中。我們檢測這四個分子在肝組織的表達時使用的是實時定量PCR,以β-actin為內(nèi)參。由于血漿RNA沒有公認(rèn)的內(nèi)參,我們檢測這四個分子在血漿中的表達時使用的是絕對實時定量PCR。結(jié)果表明,hsa_circ_0000976和hsa_circ_0007750這兩個環(huán)狀RNA分子不僅在肝癌患者血漿中的表達量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手術(shù)前血漿中的表達量高于手術(shù)后,而且在肝癌患者血漿中的表達量與肝癌組織中的表達量呈正相關(guān)關(guān)系,在肝癌組織中的表達量高于癌旁組織。hsa_circ_0139897雖然在肝癌及癌旁組織的表達量未見顯著差異,但是其在肝癌患者血漿中的表達量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手術(shù)前血漿中的表達量高于手術(shù)后,而且在肝癌患者血漿中的表達量與肝癌組織中的表達量呈正相關(guān)關(guān)系。我們推測這可能是因為肝癌組織中的hsa_circ_0139897比癌旁或健康組織中的hsa_circ_0139897更容易分泌到血漿中。因此,我們選擇hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897這3個環(huán)狀分子作為肝癌診斷標(biāo)志物進一步研究。我們通過Cut off Finder(http://molpath.charite.de/cutoff/)網(wǎng)站的ROC曲線(Euclidean distance)分析法確定了血漿中hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897用于區(qū)別肝癌和非肝癌的最佳截斷(cut off)點分別為1067,4324以及1108 copies/ml plasma,大于或等于這些cut off值的記為1,診斷為肝癌,而小于這些cut off值的記為0,診斷為非肝癌。為了提高診斷效果,我們將這三個環(huán)狀分子的組合(Panel of circRNAs,簡稱CircPanel)用于診斷肝癌。我們在兩個獨立的大規(guī)模隊列(訓(xùn)練集:158名乙肝相關(guān)肝癌患者,53名健康人,52名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者;驗證集:152名乙肝相關(guān)肝癌患者,50名健康人,54名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者)中用ROC曲線(receiver operating characteristic curve,受試者工作特征曲線)下面積(Area Under Curve,AUC),對血漿CircPanel的肝癌診斷效果進行了評價。CircPanel在區(qū)別肝癌組與非肝癌組時比AFP具有更高的診斷價值(訓(xùn)練集:AUC0.863[95%CI 0.819 0.907]vs 0.790[0.738 0.842],P=0.036;驗證集:AUC 0.843[0.796 0.890]vs 0.747[0.691 0.804],P=0.011),而CircPanel與AFP的聯(lián)合進一步提高了診斷價值(訓(xùn)練集:AUC 0.878[0.836 0.920]vs 0.790[0.738 0.842],P=0.010;驗證集:AUC 0.863[0.819 0.908]vs 0.747[0.691 0.804],P=0.002)。CircPanel在區(qū)別小肝癌(單發(fā),直徑≤3cm)組與非肝癌組時也比AFP具有更高的診斷價值(訓(xùn)練集:AUC0.862[0.796 0.928]vs 0.680[0.589 0.770],P=0.001;驗證集:AUC 0.838[0.776 0.900]vs 0.699[0.613 0.785],P=0.011),而CircPanel與AFP的聯(lián)合進一步提高了診斷價值(訓(xùn)練集:AUC 0.873[0.817 0.929]vs 0.680[0.589 0.770],P0.001;驗證集:AUC 0.874[0.823 0.925]vs 0.699[0.613 0.785],P=0.001)。重要的是,CircPanel在區(qū)別AFP陰性肝癌組與非肝癌組(訓(xùn)練集:AUC 0.838[0.761 0.914],驗證集:AUC 0.857[0.793 0.922])以及AFP陰性小肝癌組與非肝癌組(訓(xùn)練集:AUC 0.881[0.797 0.965],驗證集:AUC 0.897[0.827 0.968])時也具有較高的診斷價值。我們還將非肝癌組劃分為健康組,慢乙肝組和乙肝肝硬化組,并對CircPanel在下列幾對比較時的診斷價值進行了評價:肝癌組與健康組、肝癌組與慢乙肝組、肝癌組與乙肝肝硬化組、小肝癌組與健康組、小肝癌組與慢乙肝組以及小肝癌組與乙肝肝硬化組。綜上所述,由外周血血漿三個環(huán)狀(RNA hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)所組成的組合CircPanel具有較高的診斷價值,可以單獨或與AFP聯(lián)合使用,并且能用于小肝癌以及AFP陰性肝癌的診斷。
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圖 1-1. 人類肝癌及癌旁組織環(huán)狀 RNA 的測序及鑒定Fig. 1-1. Identification of circular RNAs by RNA-seq analyses in human liver tissues.(A) Most of the circRNAs identified in our study were overlapped with circBase. (B)Genomic origin of the circRNAs identified in human liver tissues. (C) The lengthdistribution for exonic circRNAs. (D) Clustered heat map of the differentially expressedcircRNAs in five paired HCC (T1-T5) and ANL (N1-N5) tissues. Rows represent circRNAswhile columns represent tissues. (E) We validated the differential expression of 10 circRNAsin 40 paired HCC and ANL tissues using qRT-PCR. Wilcoxon signed-rank test was used.

圖 1-2. 被選擇的 10 個環(huán)狀 RNA 分子的鑒定Fig. 1-2 The validation of the 10 selected circRNAs. (A) Schematic representation ofthe PCR strategy used to specifically detect circular transcripts. PCR primers weredesigned to be divergent on linear cDNA thereby rendering amplification impossible.However, on cDNA derived from circRNA these primers are convergent, leading to acircRNA-specific amplicon. (B) Melting curves of qRT-PCR product of verified circRNAs,indicating the specificity of qRT-PCR products with no primer dimers or nonspecificamplified products. (C) RT-PCR products with divergent primers showing a single, distinctproduct of the expected size. (D) Sanger sequencing showing the back-spliced events ofcandidate circRNAs. (E) qRT-PCR showing resistance of circRNAs to RNase R digestion.β-actin mRNAserved as a negative control.（二）肝癌中環(huán)狀 RNAcSMARCA5 的特性我們選擇了一個來源于 SMARCA5 基因第 15 和 16 外顯子的環(huán)狀 RNA 分子（命
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
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本文編號：2699397