【摘要】：目的:組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2催化染色體組蛋白H3K27me3修飾的發(fā)生,通過影響下游基因的表觀遺傳修飾狀態(tài)在基因的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)程序進(jìn)行調(diào)控,在維持細(xì)胞的正常發(fā)育與功能狀態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。EZH2的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生具有密切的相關(guān)性。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展除與腫瘤細(xì)胞本身相關(guān)之外,很大程度上還依賴于腫瘤微環(huán)境,但在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的EZH2表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及相關(guān)性背后的相關(guān)機(jī)制仍有待研究。我們以臨床肺癌患者的腫瘤樣本與Ezh2敲除小鼠模型為研究對(duì)象,證明與解析腫瘤微環(huán)境中EZH2的表達(dá)水平與肺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián),并開展大量分子層面的實(shí)驗(yàn)探索,希望通過該研究為腫瘤的診斷與治療提供新的思路。方法:1.我們利用免疫組化的方法分析患者臨床腫瘤樣本,分析腫瘤微環(huán)境中EZH2的表達(dá)情況與肺癌臨床分級(jí)以及患者預(yù)后存在的關(guān)聯(lián)。2.利用誘導(dǎo)性Ezh2敲除小鼠,分析Ezh2全身性敲除對(duì)于小鼠NK細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞比例的影響;構(gòu)建小鼠肺癌轉(zhuǎn)移模型,分析Ezh2敲除對(duì)于腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的影響;從小鼠腹水內(nèi)制備NK細(xì)胞特異性中和抗體,特異性去除小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞,分析Ezh2敲除對(duì)于小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞抗腫瘤活性的影響;并使用免疫熒光的實(shí)驗(yàn)手段分析小鼠腫瘤組織切片內(nèi)NK細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的分布,原位觀察Ezh2敲除對(duì)小鼠腫瘤微環(huán)境的影響。3.在293T細(xì)胞內(nèi)使用IP-質(zhì)譜的方法鑒定與EZH2相互作用的蛋白中是否存在有Aiolos;使用Co-IP對(duì)小鼠脾臟NK細(xì)胞內(nèi)EZH2與Aiolos之間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證;使用Duolink方法分別在小鼠脾臟NK細(xì)胞與NK92細(xì)胞系內(nèi)原位檢測EZH2與Aiolos的相互作用;構(gòu)建截短突變型Aiolos,使用Co-IP與Duolink實(shí)驗(yàn)手段在293T細(xì)胞中鑒定Aiolos與EZH2發(fā)生相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。4.利用文獻(xiàn)報(bào)道中Ikzf3與Ezh2基因敲除小鼠的NK細(xì)胞基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù),鑒定Aiolos與EZH2的潛在共同調(diào)控基因,并進(jìn)行功能分析;使用染色體免疫共沉淀的方法鑒定Aiolos與EZH2對(duì)于上述基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的富集情況;使用Aiolos抑制劑沙利度胺處理小鼠脾臟NK細(xì)胞,觀察Aiolos被下調(diào)后上述基因的表達(dá)水平是否受到影響,同時(shí)檢測抑制Aiolos對(duì)EZH2以及組蛋白修飾H3K27me3在上述基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)富集情況的影響;使用Aiolos抑制劑處理后檢測小鼠NK細(xì)胞的體外腫瘤殺傷活性。結(jié)果:1.肺癌患者臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中EZH2低表達(dá)水平的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte)的數(shù)量與患者生存期呈正相關(guān),與患者發(fā)生腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況呈負(fù)相關(guān),但與腫瘤臨床分級(jí)無顯著相關(guān)性。2.利用ERT2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Ezh2fl/fl小鼠進(jìn)行雜交最終獲得基因型為ERT2cre Ezh2fl/fl的Ezh2誘導(dǎo)型基因敲除小鼠,并發(fā)現(xiàn)Ezh2敲除之后小鼠對(duì)于肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制能力顯著增強(qiáng),且可以導(dǎo)致小鼠脾臟中NK細(xì)胞的比例上升,T細(xì)胞比例無明顯變化趨勢;NK1.1抗體介導(dǎo)的NK細(xì)胞消除使得Ezh2敲除小鼠對(duì)LLC1細(xì)胞造成肺部結(jié)節(jié)的抑制優(yōu)勢消失。3.IP-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以與EZH2發(fā)生的共沉淀蛋白中包含Aiolos;在小鼠脾臟NK細(xì)胞中進(jìn)行Co-IP發(fā)現(xiàn)EZH2與Aiolos存在相互作用;在小鼠NK細(xì)胞與NK92細(xì)胞系中進(jìn)行Duolink實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EZH2與Aiolos在原位存在相互作用;在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染截短突變型Aiolos與EZH2,Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Aiolos第七個(gè)外顯子缺失二者間相互作用消失;Duolink實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Aiolos第七個(gè)外顯子缺失二者間的胞內(nèi)共定位消失。4.對(duì)小鼠NK細(xì)胞基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)25個(gè)基因在Ikzf3與Ezh2敲除后都發(fā)生上調(diào),其中Tcf7、Icos、Gpr5 與Marks曾被報(bào)道與NK細(xì)胞發(fā)育與功能相關(guān);CHIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Aiolos與EZH2在上述基因的啟動(dòng)子存在富集;使用沙利度胺抑制小鼠NK細(xì)胞中的Aiolos可以導(dǎo)致上述基因的表達(dá)上調(diào),同時(shí)EZH2與組蛋白修飾H3K27me3在上述基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)富集降低;小鼠脾臟NK細(xì)胞經(jīng)過沙利度胺處理后體外腫瘤殺傷能力無顯著變化。結(jié)論:1.肺癌患者腫瘤微環(huán)境中浸潤性NK細(xì)胞有利于患者獲得更積極的預(yù)后,有利于延長患者生存期。2.EZH2表達(dá)缺失可以通過促進(jìn)NK細(xì)胞的發(fā)育提升小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的比例,進(jìn)而增強(qiáng)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。3.Aiolos介導(dǎo)了 EZH2對(duì)NK細(xì)胞發(fā)育與功能的部分關(guān)鍵性影響,靶向促進(jìn)了NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。
【圖文】：

Ｅｚｈｌ的表達(dá)水平在正常組織與同樣來源的腫瘤組織內(nèi)卻沒有顯著性差異［２］；發(fā)逡逑育中的腎臟內(nèi)存在Ｅｚｈ２的表達(dá)，但非分裂狀態(tài)下的成熟腎臟組織中則無法檢測逡逑到Ｅｚｈ２ｐ］（圖１）；在小鼠胚胎中，Ｅｚｈ２蛋白在淋巴細(xì)胞的生成部位，例如胎肝逡逑和胸腺存在大量富集，而在增殖活躍的生發(fā)中心Ｂ細(xì)胞（Ｃｅｎｔｒｏｂｌａｓｔｓ）中，Ｅｚｈ２逡逑也存在顯著高表達(dá)［３］，這提示Ｅｚｈ２與Ｂ細(xì)胞的活化與分裂存在相關(guān)性。Ｅｚｈ２的逡逑系統(tǒng)性敲除對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠是致死性的［４］，有課題組基于條件性基因敲除技術(shù)研逡逑宄Ｅｚｈ２，并發(fā)現(xiàn)Ｅｚｈ２通過控制免疫球蛋白／ｇＡ基囡的正常重排，對(duì)于Ｂ細(xì)胞發(fā)逡逑育發(fā)揮著決定性的作用［５］（圖１）。逡逑Ｍｏｕｓｅ邋Ｋｉｄｎｅｙ邐Ｐｒｏ—Ｂｃｅｌｌｓ邋Ｐｒｅ－Ｂｃｅｌｌｓ邋＇＾｜ｔｕｒｅ邋Ｒｅｄｒｃｕｊａｔｉｎｇ逡逑Ａｇｅ邋（ｍｏｎｔｈｓ）邋ＮＢ邋１邐３邐６邐９邐ｔｏｒ邋３：邋１邋ｔｅ邋３：邋１邐３：邋１邋ｆｃｉ邋３：邋１逡逑抓■—邐Ｅｚｈ２邋二？、逡逑Ｅｚｈ２－｜邋ｍｍ邐Ｅｚｈ１邐？邐？逡逑ＨＰｉｒｒ逡逑２００３邋Ｆｅｂ；４（２）：邋１２４－３１．逡逑Ｍｏｌ邋Ｃｅｌｌ．邋２００８邋Ｎｏｖ邋２１；３２（４）：５０３－１８．逡逑圖１，Ｅｚｈ２的表達(dá)模式及其與發(fā)育的相關(guān)性。逡逑左圖，小鼠腎臟內(nèi)Ｅｚｈｌ與Ｅｚｈ２的表達(dá)水平隨小鼠周齡增長的變化趨勢，以逡逑Ｔｕｂｕｌｉｎ為對(duì)照內(nèi)參；右圖，在小鼠Ｂ淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中，Ｅｚｈ２與Ｅｚｈｌ的表逡逑達(dá)水平變化趨勢

項(xiàng)包含７００個(gè)病人的臨床研宄，ＥＺＨ２被證明與腫瘤細(xì)胞的分裂增殖活躍程度相逡逑關(guān)［１１］，此外ＥＺＨ２的表達(dá)過量可以作為強(qiáng)侵襲性的腫瘤亞型重要標(biāo)記，，ＥＺＨ２高逡逑表達(dá)的腫瘤對(duì)應(yīng)相對(duì)縮短的患者生存期（圖２）。逡逑ＥＺＨ２ｌｏｗ邐ＥＺＨ２ｈｉｇｈ逡逑ｍｅｌａｎ0ｍａ＿除哆３邋：：——逡逑＝

本文編號(hào)：2699394