【摘要】：前言腎細胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是成人最常見的腎臟惡性腫瘤,近年來腎癌流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,腎癌特別是腎細胞癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于復(fù)雜的發(fā)病特點及遺傳學(xué)、組織學(xué)的多樣性,腎細胞癌缺乏臨床上特異性的分子診斷標記物。因此,臨床上針對腎癌的早期診斷,預(yù)后評價,術(shù)后跟蹤及靶向治療效果判定等方面仍然缺乏有效手段。近年來,針對腎細胞癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制研究顯示,以抑癌基因VHL突變失活及其下游缺氧誘導(dǎo)因子HIF-VEGF分子通路激活為基礎(chǔ)的缺氧誘導(dǎo)新生血管形成機制是最重要的腎癌分子病理基礎(chǔ)之一。同時,針對腎癌的代謝組學(xué)相關(guān)研究提示,在低氧狀態(tài)下,腎細胞癌的能量代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此,針對腫瘤的代謝調(diào)控成為近年來腎癌治療的熱點方向。蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Posttranslational modifications,PTMs)是指蛋白質(zhì)在翻譯后經(jīng)歷的共價加工過程,通常是通過對其特定的氨基酸殘基加上修飾基團或經(jīng)蛋白水解剪去基團的過程。PTMs通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性、亞細胞定位以及蛋白質(zhì)間相互作用,促進了蛋白質(zhì)的功能多樣性,是擴大基因編碼、調(diào)節(jié)細胞生理功能的有效機制,并與幾乎所有已知的細胞通路和疾病相關(guān)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的PTMs類型被鑒定出來。有證據(jù)表明,蛋白質(zhì)翻譯后修飾在不同的生物過程,如細胞的調(diào)節(jié)分化和有機體的發(fā)育以及多種物質(zhì)代謝等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。異常的蛋白質(zhì)翻譯后修飾可能與包括腫瘤在內(nèi)的多疾病密切相關(guān)。賴氨酸琥珀�；揎検切陆l(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型,是琥珀�；w通過酶學(xué)或者非酶學(xué)的方式將琥珀酰基團共價結(jié)合到賴氨酸殘基的過程。琥珀�；峭ㄟ^酶學(xué)或者非酶學(xué)的方式將一個負電荷四碳琥珀�；鶊F共價結(jié)合到賴氨酸殘基的伯胺上的過程。相較于甲基化和乙�；刃揎�,琥珀�；梢詡鬟f更大的結(jié)構(gòu)基團并誘導(dǎo)蛋白電荷出現(xiàn)更大的改變。因此,蛋白質(zhì)的賴氨酸琥珀�；揎椏赡艽龠M蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生更加明顯的實質(zhì)性改變。目前通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定分析,許多代謝酶包括糖酵解,三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶都發(fā)生了琥珀�；揎�。這可能提示琥珀酰化修飾廣泛參與了與能量代謝相關(guān)的生物過程,并發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。但蛋白質(zhì)賴氨酸琥珀�；揎棇Φ鞍踪|(zhì)的具體調(diào)控機制仍然不夠明確。目前針對琥珀�；揎棇δ[瘤進程的作用也少有報道。因此,本研究擬通過對腎細胞癌組織的蛋白組與賴氨酸琥珀酰化修飾組的鑒定和分析,探討腎細胞癌組織中琥珀�；揎椀谋磉_水平及其對腎癌能量代謝過程的潛在作用,為腎細胞癌的診斷及靶向治療提供新的思路和方向。方法一、樣本收集(一)腎細胞癌組織樣本收集本研究對腎細胞癌組織樣本的收集獲得了中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準和支持。我們共收集了9對腎細胞癌及與之對應(yīng)的癌旁組織用于LC-MS/MS的鑒定分析,10對腎細胞癌及癌旁組織液氮凍存標本,以及45對腎細胞癌及癌旁組織石蠟包埋標本。這些標本取自2015年9月至2017年12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)治療的腎細胞癌患者。所有患者術(shù)前均簽署了科研知情同意書。所有患者術(shù)前均未接受任何治療,所有標本術(shù)后病理診斷均為腎透明細胞癌。(二)細胞培養(yǎng)本研究培養(yǎng)了OSRC、769-P、ACHN腎癌細胞系,細胞系均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科研究所。二、檢測方法(一)蛋白質(zhì)組和賴氨酸琥珀酰化修飾組的定量分析利用LC-MS/MS技術(shù)鑒定腎癌及癌旁組織中的蛋白組表達,定量差異表達蛋白;利用琥珀�；嚎贵w富集,經(jīng)LC-MS/MS鑒定琥珀�；揎椊M的表達,定量差異表達位點及相關(guān)蛋白。(二)差異蛋白組及差異琥珀�；揎椊M的富集和功能分析通過GO、KEGG pathway對鑒定到的差異蛋白及差異表達的琥珀酰化修飾位點進行功能富集,明確差異蛋白尤其是差異的琥珀�；揎椏赡軈⑴c的生物學(xué)過程。(三)分析差異蛋白組及差異表達的琥珀�；揎椢稽c的相關(guān)性構(gòu)建蛋白-蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò),標準化差異琥珀�；揎椢稽c,明確差異蛋白及差異琥珀�；揎椢稽c的相關(guān)性,篩選出潛在的作用靶點。(四)檢測PGK1及PKM2在腎細胞癌組織中的表達通過Oncomine數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫提取分析PGK1及PKM2的基因水平表達。Western blot檢測腎細胞癌組織中PGK1及PKM2蛋白的表達。(五)分析PGK1蛋白的臨床意義免疫組化檢測腎細胞癌組織中PGK1的原位表達情況,分析PGK1蛋白表達水平與腎細胞癌組織病理分級的相關(guān)性。(六)檢測PGK1的琥珀�；揎椩谀I細胞組織中的表達免疫沉淀富集腎細胞癌組織及癌旁組織中PGK1蛋白,利用琥珀�；嚎贵w檢測PGK1的琥珀酰化修飾的表達水平。(七)細胞水平檢測PGK1對腎癌細胞生物行為學(xué)的影響利用RNAi技術(shù)干擾腎癌細胞系OSRC和ACHN中PGK1的內(nèi)源性表達,通過CCK8細胞增殖實驗檢測細胞的增殖能力變化,通過Transwell實驗檢測細胞的遷移能力變化。(八)檢測SIRT5對PGK1的琥珀�；揎椝降挠绊懲ㄟ^Oncomine數(shù)據(jù)庫提取SIRT5基因在腎細胞癌組織中的表達情況。在腎癌細胞系A(chǔ)CHN中過表達SIRT5,應(yīng)用免疫沉淀富集PGK1,Western blot檢測PGK1琥珀�；磉_水平。(九)細胞水平檢測Sirt5對腎癌細胞生物行為學(xué)的影響通過CCK8細胞增殖實驗檢測細胞的增殖能力變化,通過Transwell實驗檢測細胞的遷移能力變化。結(jié)果一、腎細胞癌組織中差異蛋白質(zhì)組和賴氨酸琥珀�；揎椊M的定量分析通過高分辨率LC-MS/MS分析,我們從這9對RCC組織樣本中共鑒定出4116個蛋白質(zhì),其中3217個蛋白質(zhì)可以量化。經(jīng)過閾值篩選,有668種蛋白質(zhì)在腫瘤組織及癌旁組織中存在差異表達,包括了189個上調(diào)和479個下調(diào)蛋白。在這9對RCC組織樣本中,我們共鑒定到了1090個蛋白質(zhì)中1668個賴氨酸琥珀�；揎�(Ksucc)位點,其中844個蛋白中的1238個Ksucc位點被定量。與癌旁組織相比,我們在腫瘤組織中篩選到47個蛋白質(zhì)中的51個Ksucc位點表達上調(diào),95個蛋白質(zhì)中的110個Ksucc位點表達下調(diào)。二、差異蛋白組及差異琥珀�；揎椊M的富集和功能分析我們通過對差異蛋白組及差異琥珀酰化修飾組的GO富集和KEGG pathway分析,發(fā)現(xiàn)上調(diào)的琥珀�；揎椀鞍赘患谔墙徒�、氨基酸的生物合成和hHIF-1信號通路的相關(guān)蛋白。與之相對,琥珀�；揎椣抡{(diào)的蛋白質(zhì)富集在碳代謝、TCA循環(huán)和脂肪酸代謝等通路過程中。我們進一步對琥珀�；稽c及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)表達量做了關(guān)聯(lián)分析。篩選出HspB1、FGA、COL6A3、FN、PGK1、PKM等蛋白的琥珀�；揎椬顬轱@著。需要在組織和細胞水平進一步驗證。三、PKM2、PGK1及其琥珀�；揎椩谀I細胞癌組織中的表達及意義通過Oncomine數(shù)據(jù)庫提取的關(guān)于PGK1和PKM2基因在腫瘤中的芯片數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)PGK1和PKM2 mRNA在RCC組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài);Western blot檢測PGK1和PKM2蛋白在RCC組織中同樣呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。免疫沉淀富集PGK1蛋白后應(yīng)用琥珀酰化泛抗體檢測結(jié)果顯示免疫組化結(jié)果顯示:PGK1在RCC腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài),并定位于細胞質(zhì)與細胞核中。染色評分與RCC病理分級呈顯著的正相關(guān)。四、細胞水平檢測PGK1對腎癌細胞增殖及遷移能力的影響我們通過RNAi技術(shù)構(gòu)建了PGK1特異siRNA,抑制了腎癌細胞系OSRC和ACHN中的PGK1表達水平。CCK8細胞增殖實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染siRNA后,與對照組相比較,OSRC和ACHN的細胞增殖能力明顯下降。Transwell細胞遷移實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染siRNA后,與對照組相比較,OSRC和ACHN的細胞遷移能力也明顯受到抑制。五、檢測SIRT5對PGK1的琥珀�；揎椝郊皩δI癌細胞增殖及遷移能力的影響我們首先通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫中腎癌組織基因芯片數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)SIRT5mRNA在腎細胞癌組織中明顯降低。我們在ACHN細胞中構(gòu)建了SIRT5過表達質(zhì)粒,上調(diào)了細胞的SIRT5內(nèi)源性表達。通過免疫沉淀富集PGK1,利用泛琥珀�；揎椏贵w檢測結(jié)果顯示:過表達SIRT5的ACHN細胞中,PGK1的琥珀酰化修飾受到明顯抑制。CCK8及Transwell實驗結(jié)果顯示:過表達SIRT5后,腎癌細胞的增殖能力和遷移能力均出現(xiàn)顯著下降。六、統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)顯示,統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件進行。配對樣本數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗,隨機樣本組間比較采用獨立樣本t檢驗。判定差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標準設(shè)定為P0.05。結(jié)論1、在RCC中,存在較高豐度的賴氨酸琥珀�；揎椢稽c,并且其差異表達的蛋白集中于糖酵解、氧化磷酸化、TCA循環(huán)、脂肪酸代謝等能量代謝通路中。2、糖酵解關(guān)鍵酶PKM2、PGK1及其賴氨酸琥珀�；揎椩谀I細胞癌中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。免疫組化結(jié)果顯示:PGK1在RCC組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài),并定位于細胞質(zhì)與細胞核中。PGK1染色評分與RCC病理分級呈顯著的正相關(guān)。3、PGK1能夠顯著影響腎癌細胞的增殖能力和遷移能力。4、SIRT5在腎癌組織中呈低表達狀態(tài),并可能通過其去琥珀�；拿富钚哉{(diào)控PGK1的琥珀酰化修飾,從而影響腎癌細胞的增殖和遷移能力。
【圖文】：

10圖 1.1 在 RCC 及其癌旁組織中定量分析全蛋白質(zhì)組和賴氨酸琥珀�；揎椀南到y(tǒng)工作流程3.2 RCC 及癌旁組織中全蛋白質(zhì)組的鑒定與功能分析3.2.1 RCC 及癌旁組織中全蛋白質(zhì)組的鑒定

圖 1.2 RCC 及其癌旁組織中對全蛋白質(zhì)組的識別和功能分析注：A 和 B 為通過 GO 功能富集分析得到的上調(diào)和下調(diào)的蛋白；C 和 D 為通過KEGG pathway 分析得到的上調(diào)和下調(diào)的蛋白。3.2.3 KEGG pathway 分析糖酵解/氧化磷酸化通路相關(guān)的差異蛋白具體來說，相比于癌旁組織，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的能量代謝的變化。線粒體中上調(diào)的糖酵解和下調(diào)的氧化磷酸化過程表明，在 RCC 組織中葡萄糖可以通過厭氧而不是的有氧途徑來代謝供能的�；谔墙徒馔緩綌�(shù)據(jù)(圖 1.3A)，，我們發(fā)現(xiàn)與糖酵解有關(guān)的主要蛋白質(zhì)和關(guān)鍵酶明顯增加，而對檸檬酸循環(huán)至關(guān)重要的相關(guān)酶卻大量減少了。與此同時，許多與線粒體氧化磷酸化過程相關(guān)的蛋白表達量也明顯減少(圖1.3B)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.11

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱偉偉;韋嬪;;廢蠶絲中絲素蛋白的琥珀酰化改性研究[J];廣東化工;2014年03期

2 李浩;王征科;胡巧玲;;N-琥珀酰殼聚糖的制備及其性能[J];材料科學(xué)與工程學(xué)報;2011年04期

3 吳景;楊光;楊鵬飛;;琥珀酰化對玉米醇溶蛋白消化率的影響[J];食品工業(yè)科技;2007年01期

4 張軍濤;李理;楊曉泉;;琥珀�；撝蛊闪髯冃再|(zhì)研究[J];現(xiàn)代食品科技;2007年08期

5 張紅印,朱加進,鄭曉冬,席q芳,王蘭;小麥面筋蛋白琥珀�；男匝芯縖J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年03期

6 李蓉;陳雪嵐;;蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的琥珀酰化修飾[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2018年12期

7 李銘;熊小英;謝晶;薛斌;銀旭紅;孫濤;;N-琥珀酰低聚殼聚糖的抗氧化性能研究(英文)[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2014年10期

8 張軍濤;楊曉泉;黃立新;;琥珀�；撝蛊烧澈闲再|(zhì)及流變性質(zhì)研究[J];中國油脂;2007年11期

9 汪琴;王麗;王愛勤;;不同因素對N-琥珀酰殼聚糖特性黏度的影響[J];中國生化藥物雜志;2005年06期

10 汪琴,王愛勤;N-琥珀酰殼聚糖的合成和性能研究[J];功能高分子學(xué)報;2004年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 R壚

本文編號：2697876