【摘要】：背景:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅著女性的生命健康。化療是治療乳腺癌的重要手段,乳腺癌新輔助化療已被廣泛應用于臨床,但多耐藥的的產(chǎn)生又是導致化療失敗的關鍵因素。近年來,越來越多的實驗證實miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥密切相關。MiRNAs能夠通過堿基互補配對的方式阻礙或降解靶mRNA從而抑制藥物誘導的凋亡基因或信號傳導通路基因,導致耐藥。MiRNA-1268b是一種在任何腫瘤中尚未深入研究且功能機制不清楚的miRNA分子。本研究揭示了miR-1268b對乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及化療耐藥的調(diào)節(jié)機制。方法:首先從乳腺癌耐藥相關的miRNA組織芯片中選取了具有表達差異的miR-1268b。隨后收集乳腺癌穿刺組織樣本及同病例化療后手術(shù)切除組織樣本,并根據(jù)化療敏感性分為敏感組和耐藥組,通過查閱及電話隨訪完善各病例的臨床資料。用試劑盒從組織標本中提取總miRNA,逆轉(zhuǎn)錄,實時熒光定量PCR檢測每例組織樣本中miR-1268b的表達量,并根據(jù)結(jié)果進行臨床資料分析,從而進一步確定miR-1268b為研究對象。在乳腺癌兩種細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染促進miRNA過表達和抑制其表達的miRNA mimics和inhibitor,并用CCK8和EdU實驗檢測miR-1268b對乳腺癌增殖能力的影響。用Transwell實驗檢測miR-1268b對乳腺癌細胞遷移和浸潤能力的影響。用流式細胞學技術(shù)檢測miR-1268b對乳腺癌細胞凋亡能力的影響。用miRWalk2.0綜合十種軟件預測miR-1268b的靶基因,并構(gòu)建與靶基因結(jié)合位點的3'UTR質(zhì)粒,用雙熒光素酶實驗、Western blot和細胞免疫組化進行驗證。通過軟件預測和通路數(shù)據(jù)庫查詢,確定經(jīng)典經(jīng)典下游通路PI3K-Akt進一步研究,實時熒光定量PCR及Western blot驗證miR-1268b與該通路中的分子及凋亡相關蛋白的關系。結(jié)果:實時熒光定量PCR檢測及臨床病理參數(shù)分析:RT-qPCR及臨床資料分析結(jié)果顯示,miR-1268b在化療敏感組織中高表達,并且與腫瘤分期有關。并且隨著腫瘤分期的增加,miR-1268b的表達量降低。隨后驗證了 miR-1268b在乳腺癌7中細胞系中的表達,其中miR-1268b在ERBB2陽性細胞中低表達。在親本細胞MCF-7中較耐阿霉素乳腺癌細胞MCF-7/ADM的表達顯著上調(diào)。同時,在低侵襲力的乳腺癌細胞中,miR-1268b的表達相比于高侵襲力的乳腺癌細胞明顯增加。體外細胞功能學實驗:增殖實驗EdU和CCK8、遷移浸潤實驗證明在乳腺癌兩種細胞系中上調(diào)或下調(diào)miR-1268b的表達,細胞增殖能力和遷移浸潤能力均未發(fā)生明顯變化。凋亡實驗中,分別在乳腺癌兩種細胞系中上調(diào)miR-1268b的表達量可以促進乳腺癌細胞凋亡,下調(diào)miR-1268b可以抑制乳腺癌細胞的凋亡,提示miR-1268b與乳腺癌細胞的凋亡能力呈正相關。在一定藥物濃度梯度中,上調(diào)miR-1268b的表達可以抑制細胞的活力,下調(diào)可以促進細胞活力,提示miR-1268b可以抑制乳腺癌細胞的耐藥性。靶基因預測和驗證:用miRWalk2.0綜合十種軟件分別預測miR-1268b的靶基因,并通過查文獻及雙熒光素酶實驗檢測,證實miR-1268b可與ERBB2的3'-UTR區(qū)結(jié)合。Western blot和細胞免疫組化實驗進一步證明,在miR-1268b過表達的細胞中相較于對照組,ERBB2和AKT2的表達量明顯降低,提示ERBB2為miR-1268b的直接靶基因。通路預測和驗證:通過軟件預測和通路數(shù)據(jù)庫查詢,確定經(jīng)典經(jīng)典下游通路ERBB2-PI3K-AKT進一步研究,實時熒光定量PCR及western blot驗證miR-1268b可以顯著下調(diào)該通路中的分子ERBB2、PIK3CA、AKT,同時可以下調(diào)與凋亡相關的蛋白Bcl2。結(jié)論:MiR-1268b可以通過下調(diào)ERBB2-PI3K-Akt通路抑制乳腺癌化療耐藥,另一方面也可以通過下調(diào)Bc12的表達促進凋亡,從而抑制乳腺癌化療耐藥。
【圖文】：

圖１．邋ｍｉＲ－１２６８ｂ在乳腺癌組織和細胞系中的差異表達。逡逑（Ａ）邐ＲＴ－ｑＰＣＲ結(jié)果顯示，相比在乳腺癌耐藥組中，ｍｉＲ－１２６８ｂ在乳腺癌敏感組中表達上逡逑調(diào)邋９．６邋倍（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。逡逑（Ｂ）邐ｍｉＲ－１２６８ｂ在ＥＲＢＢ２低表達組中相較于ＥＲＢＢ２高表達組上調(diào)１７．５倍（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。逡逑（Ｃ）檢測乳腺癌６種細胞系中ｍｉＲ－１２６８ｂ的表達，相比于其他細胞系，ｍｉＲ－１２６８ｂ在乳腺逡逑癌耐阿霉素細胞系ＭＣＦ－７／ＡＤＭ和ＥＲＢＢ２過表達細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－４５３中低表達。其中，逡逑ｍｉＲ－１２６８ｂ邋在邋ＭＣＦ－７邋中的表達比在邋ＭＣＦ－７／ＡＤＭ邋中的表達高邋７．９邋倍（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。逡逑（Ｄ，Ｅ）在乳腺癌兩種細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ａｎｄ邋ＭＤＡ－ＭＢ－４６８中，轉(zhuǎn)染ｍｉＲ－１２６８邋ｍｉｍｉｃｓ逡逑或ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｍｉＲ－１２６８ｂ的表達量分別上調(diào)３１２？１３３６３倍或者下調(diào)２逡逑

圖２．邋ｍｉＲ－１２６８ｂ對乳腺癌細胞的增值能力無明顯影響。逡逑（Ａ，Ｂ，Ｅ，，Ｆ）ＥＤＵ實驗結(jié)果顯示，在乳腺癌兩種細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和ＭＤＡ－ＭＢ－４６８逡逑中，ｍｉＲ－１２６８ｂ過表達對乳腺癌細胞的增殖能力無明顯作用。逡逑（Ｃ，邋Ｄ，ＱＨ）ＥＤＵ實驗結(jié)果證明，ｍｉＲ－１２６８ｂ低表達，乳腺癌細胞的增殖能力無明顯變化。逡逑（Ｉ，邋Ｊ，邋Ｋ，邋Ｌ）邋ＣＣＫ８實驗與ＥＤＵ實驗結(jié)果一致，ｍｉＲ－１２６８ｂ對乳腺癌細胞增殖能力無明顯影逡逑響。逡逑３８逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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本文編號：2697712