【摘要】：背景:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性腫瘤之一,其死亡率占我國癌癥死亡率第三位。手術(shù)、放療及化療是目前治療HCC的三大常規(guī)方法,但療效仍不理想,尋找更有效而安全的療法成為HCC治療的新趨勢。縱觀腫瘤治療研究歷程,以腫瘤免疫治療為代表的生物治療在控制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的過程中可發(fā)揮重要作用,而以樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)介導(dǎo)的腫瘤免疫治療有良好的前景。因?yàn)镈C細(xì)胞是最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞,能有效提呈特異性抗原給T細(xì)胞,誘生特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)。本課題組前期應(yīng)用SEREX(重組c DNA表達(dá)文庫的血清學(xué)分析技術(shù)),從廣西人肝細(xì)胞癌c DNA文庫中篩選出多種編碼HCC腫瘤相關(guān)抗原基因的克隆,DNA測序發(fā)現(xiàn)其中一種抗原與SMP30羧基末端165個氨基酸是同源結(jié)構(gòu),相應(yīng)抗體主要見于HCC患者,尤其有趣的是在甲胎蛋白陰性的肝癌患者發(fā)現(xiàn)有SMP30抗體高陽性檢測率。我們利用重組表達(dá)的SMP30蛋白致敏人DC發(fā)現(xiàn)其能有效刺激自體T淋巴細(xì)胞的增殖,且可誘導(dǎo)生成對肝癌細(xì)胞株BEL-7404有一定殺傷效應(yīng)的CTL。我們的研究小組較早地顯示SMP30在HCC癌旁組織中高度表達(dá),但在HCC組織中具有低水平。糖蛋白96(gp96)屬于熱休克蛋白90(HSP90)家族,是免疫治療中眾所周知的佐劑。HSP-抗原復(fù)合物可以通過抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞以受體介導(dǎo)的方式相當(dāng)有效地攝取。同時,HSP-抗原肽復(fù)合物中的抗原或HSP與樹突細(xì)胞相互作用,刺激樹突狀細(xì)胞表達(dá)MHC II類分子,分泌細(xì)胞因子和趨化因子,導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞成熟并遷移到引流淋巴結(jié),向T細(xì)胞呈遞抗原,啟動CTL應(yīng)答。因此,基于其佐劑作用的HSP制劑疫苗在癌癥或傳染病的免疫治療中引起更多關(guān)注。另外,HSP能誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生,作用更持久。在III期臨床試驗(yàn)中,GP96已被證明對CTL細(xì)胞有高效促進(jìn)作用,具有良好的抗癌作用。在國內(nèi)外相關(guān)研究報道中,目前采用的增強(qiáng)腫瘤抗原免疫原性的方式主要包括體外合成腫瘤抗原肽、完全腫瘤抗原負(fù)載DC以及腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染DC等。腫瘤病人免疫功能各環(huán)節(jié)是減弱的,不管是APC表面受體,還是腫瘤抗原及其伴侶分子,或是MHC-I類分子均有可能不利于腫瘤抗原加工和遞呈,從而影響CTL細(xì)胞形成。采用體外沖擊致敏DC的方法具有直接、起效快等特點(diǎn),但難以誘導(dǎo)持久抗腫瘤免疫反應(yīng)。將腫瘤抗原的基因?qū)隓C后可使抗原表達(dá)持久,容易進(jìn)入MHC-I類抗原呈遞途徑。因此,將表達(dá)腫瘤抗原肽的基因的載體轉(zhuǎn)染DC構(gòu)建的腫瘤疫苗具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢。目的:目前國內(nèi)外先后報道了一些肝癌相關(guān)抗原負(fù)載DC疫苗的研究,甲胎蛋白(AFP)是目前公認(rèn)的肝癌標(biāo)志物,盡管有研究表明AFP基因轉(zhuǎn)染DC可誘導(dǎo)特異性CTL靶向殺傷AFP陽性的肝癌細(xì)胞,但其免疫反應(yīng)強(qiáng)度仍距臨床應(yīng)用很遠(yuǎn);日本研究者用HSP70 m RNA轉(zhuǎn)染DC,進(jìn)行12例肝癌免疫治療I期臨床試驗(yàn),但這種技術(shù)涉及RNA容易降解,且單基因修飾DC疫苗的效果也很有限。因此,目前基于DC疫苗的肝癌免疫治療并不能令人滿意,仍然有很多工作要做。基于現(xiàn)有文獻(xiàn)報道和我們的前期研究,我們提出科學(xué)假說,人肝癌相關(guān)抗原SMP30蛋白基因與GP96基因聯(lián)合轉(zhuǎn)入DC可持續(xù)使其致敏并可增強(qiáng)DC抗原呈遞功能,成為更強(qiáng)有效的特異性抗肝癌疫苗。本研究旨在探討SMP30聯(lián)合GP96負(fù)載DC誘生CTL能否增強(qiáng)抗肝癌免疫效應(yīng)。加上我們以前的研究結(jié)果,進(jìn)一步了解SMP30在HCC免疫治療中的作用,為開展以SMP30作為干預(yù)靶點(diǎn)的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:我們用生物信息學(xué)技術(shù)查詢基因序列,將SMP30和GP96基因片段先后導(dǎo)入慢病毒載體構(gòu)建真核重組子,然后轉(zhuǎn)染健康志愿者DC,將實(shí)驗(yàn)組分為smp30-gp96組,GP96組,SMP30組,DC組,空載體組,肝癌組織提取液孵育DC組。流式細(xì)胞術(shù)評估轉(zhuǎn)染前后DC的CD80和CD86及CCR7變化。用DC疫苗和T細(xì)胞共培養(yǎng),得到相關(guān)的CTL,其上清液用ELISA檢測腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)等細(xì)胞因子。并與靶細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株SMMC7721混合培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測CTL殺傷效應(yīng)。將5-6周齡的雌性BALB/c裸鼠(無特殊病原體,SPF)皮下(s.c.)注射SMMC-7721細(xì)胞(13107個)到小鼠的右側(cè)腹皮下,每隔4天注射一次,注射兩次成瘤后,第9天將小鼠隨機(jī)分配為實(shí)驗(yàn)組和對照組,每組4只小鼠。實(shí)驗(yàn)組腫瘤塊內(nèi)注射gp96-smp30修飾DC誘生的CTL(13108),CTL每隔一天皮下注射一次,總共七次。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對照組注射PBS。16天后使動物安樂死,稱重移植瘤,對照各組小鼠的腫瘤生長變化與小鼠存活情況、血清免疫指標(biāo)改變情況。觀察腫瘤內(nèi)組織變化。結(jié)果:SMP30和GP96基因片段能先后導(dǎo)入同一慢病毒載體,轉(zhuǎn)染DC后使其表達(dá)更多CCR7、CD86和CD80等表面分子,分泌更多IL-1及IFN-γ;smp30-gp96組、SMP30組和肝癌組織裂解液組DC誘生的CTL分泌的細(xì)胞因子(INF-α,INF-γ,TNF-α,TNF-β和IL-12等)比空載組和空白組更多。有顯著性差異(P0.05/0.01);但這三組之間無顯著性差異。所誘生的CTL對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞具有更強(qiáng)殺傷效應(yīng)。荷人瘤小鼠體內(nèi)試驗(yàn)顯示,gp96-smp30轉(zhuǎn)染DC誘生的CTL也能有效減小小鼠荷人肝癌瘤體,血清中檢測到更多INF-γ和IL-6,腫瘤組織內(nèi)肝癌細(xì)胞凋亡增多。結(jié)論:我們成功將SMP30和GP96基因片段先后導(dǎo)入慢病毒載體構(gòu)建雙目的基因真核重組子;SMP30和GP96雙目的基因組(混合組)、SMP30組和裂解液組與空載組和空白組相比,促進(jìn)DC成熟;加強(qiáng)抗原提呈能力。混合組、SMP30組和裂解液組致敏的DC都能顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖;混合組、SMP30組和裂解液組DC誘生的CTL與空載組和空白組相比,對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞具有更強(qiáng)殺傷效應(yīng);體外實(shí)驗(yàn)表明:混合組與單獨(dú)的SMP30組相比,致敏DC作用(產(chǎn)生表面分子CCR7,CD86和CD80以及分泌IFN-γ和IL-1)、促進(jìn)T細(xì)胞增殖作用、誘生CTL并分泌細(xì)胞因子(INF-α,INF-γ,TNF-α,TNF-β和IL-12)以及對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞殺傷效應(yīng)等作用,基本無顯著性差異;但與gp96組相比呈現(xiàn)出有顯著增強(qiáng)的趨勢;綜合本研究結(jié)果初步表明:SMP30和GP96雙目的基因組(混合組)與裂解液組有相同的抗HCC效果。但兩組的特異性和毒副作用有待進(jìn)一步比較;單獨(dú)SMP30抗HCC效果作用強(qiáng)于單獨(dú)gp96作用;混合組抗HCC作用,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果優(yōu)于體外實(shí)驗(yàn),SMP30與GP96都能介導(dǎo)慢病毒促進(jìn)DC成熟,進(jìn)而誘生CTL,且兩者可能有協(xié)同作用。GP96與SMP30分別介導(dǎo)慢病毒共轉(zhuǎn)染DC,可以協(xié)同刺激DC促進(jìn)其成熟,加強(qiáng)抗原提呈能力,進(jìn)而可誘生CTL并產(chǎn)生更多IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β和IL-12,獲得更好的體內(nèi)外抗人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞作用。
【圖文】：

GP96慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖(GP96lentiviralvectorstructure)

SMP30慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖(SMP30lentiviralvectorstructure)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

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