【摘要】：肺癌是世界范圍內癌癥死亡的主要原因,由于快速增長的煙草消費,發(fā)展中國家肺癌的發(fā)病趨勢在增加。然而,非吸煙患者也占據了所有肺癌的25%。傳統上,吸煙對男性的影響超過女性,但是由于近代女性的吸煙人群增多,導致女性肺癌增加且更易發(fā)生腺癌。其中,非小細胞肺癌是肺癌最常見的組織學類型,約占肺癌總數的80-85%。盡管出現諸多新的治療聚焦于肺癌,但是總體生存率的提高并不明顯。辨別調節(jié)腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移的關鍵基因及蛋白,并研究其內在分子機制是十分重要的。盡管我們的課題組之前的研究提示GBP1和PDHA1在其它腫瘤中具有重要的相互作用,二者在非小細胞肺癌中的研究還未見報道。丙酮酸是三羧酸循環(huán)、糖酵解和磷酸戊糖途徑的關鍵代謝中間產物,而線粒體介導的丙酮酸氧化過程是真核細胞中糖、脂肪酸和氨基酸代謝途徑的核心。在人體細胞中,葡萄糖的糖酵解過程產生丙酮酸,繼而有多個載體蛋白和酶復合物參與丙酮酸的分解代謝,其中PDHA1也就是丙酮酸脫氫酶(Pyruvate Dehydrogenase,PDH)E1α亞單位屬于關鍵性樞紐。葡萄糖代謝生成的丙酮酸,首先由位于線粒體內膜上的丙酮酸轉運載體(mitochondrial pyruvate carrier,MPC)自胞漿轉運進入線粒體基質,隨后在丙酮酸脫氫酶復合體(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)的作用之下,生成乙酰-CoA進入三羧酸循環(huán)進行氧化磷酸化。其中丙酮酸脫氫酶E1α亞單位(PDHA1)的磷酸化和去磷酸化,決定PDC失活和激活。PDHA1蛋白的正常表達是線粒體中三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化正常進行的前提條件。細胞中的線粒體氧化磷酸化和糖酵解是兩大產能途徑,其中丙酮酸起到聯系糖酵解和三羧酸循環(huán)的功能,干擾丙酮酸的代謝可能改變線粒體氧化磷酸化和糖酵解相對比率。在1920s,Otto Warburg提出了驚人的發(fā)現,即有氧糖酵解(Warburg效應)是腫瘤的主要代謝特點。即使在氧充足的情況下,腫瘤細胞也傾向糖酵解代謝。與氧化磷酸化比較,有氧糖酵解看起來似乎有悖于正常細胞的糖代謝,是一個低效產生ATP的途徑。盡管有氧糖酵解現在已經被廣泛接受為腫瘤的代謝特征,而且Warburg效應是腫瘤領域的研究熱點,其與腫瘤進展的內在機制至今仍不太清楚。因此,深入研究腫瘤代謝,探索細胞的所有小分子路徑的相互作用,可以揭示有利于腫瘤細胞存活和繁殖的獨特微環(huán)境。有研究表明PDC活性降低后,PDHA1活性也隨之下降,失去了將丙酮酸轉化為乙酰-CoA的作用,進而造成大量乳酸堆積。其中PDHA1的活性位點被抑制后可調節(jié)PDC與PDH活性,進而使Warburg效應增強,腫瘤細胞的侵襲性增強。我們課題組前期對前列腺癌、卵巢癌中的PDHA1基因進行了相關研究,發(fā)現缺氧可以導致PDHA1表達下降及GBP1表達增強,并且使腫瘤細胞干性增強。GBPs(guanylate-binding protein,P65家族)是一類主要的干擾素誘導基因,與p47家族、MX家族同屬于鳥苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)超級大家族。GBPs可以強化宿主免疫蛋白功能,包括吞噬細胞氧化酶、抗菌肽和自噬效應蛋白從而消滅細胞內病原體。而鳥苷酸結合蛋白1(guanylate-binding protein 1,GBP1)屬于一大類GTPase,通過炎癥因子刺激,由IFN-γ誘導產生,對病原微生物也具有較好的抵抗力。國外的學者通過GBP1與腫瘤進展關系的研究發(fā)現,GBP1表達可以增加表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)刺激、促進EGFR表達,并且通過刺激P38MAPK信號傳導及EGFRVIII促進GBP1的轉錄水平表達。GBP1單獨表達可充分增加細胞增殖、血管生成、減少凋亡。因此,GBP1可能是一個新的致瘤基因。已有研究表明,腫瘤細胞可以通過代謝重編程包括降低PDHA1的活性來加強糖酵解,促進腫瘤細胞的增殖和轉移。因此,PDHA1及GBP1的表達可能在某種程度上具有一定的反向相關性,兩者的表達對非小細胞肺癌的發(fā)生及侵襲、轉移等生物學行為值得研究。腫瘤細胞或多或少的處于缺氧的微環(huán)境中,缺氧能維持腫瘤的未分化狀態(tài),減慢腫瘤的生長,使其處于休眠期,尤其是可以誘導分化的腫瘤細胞“去分化”而獲得干性。日益增加的證據證明腫瘤是一種與干細胞相關的疾病。腫瘤細胞干性增強,促進了腫瘤的生長、浸潤、轉移和復發(fā)的潛力。本課題是通過缺氧環(huán)境下對非小細胞肺癌細胞株的培養(yǎng),檢測缺氧、PDHA1及GBP1三者之間的關系及其對非小細胞肺癌惡性表征的影響,并通過基因沉默技術對PDHA1和GBP1表達的相互影響關系進行了實驗研究。我們的研究發(fā)現,PDHA1的低表達以及GBP1的高表達與非小細胞肺癌的惡性臨床病理指標和預后差相關;在低氧狀態(tài)下幸存下來的非小細胞肺癌細胞下調了PDHA1的表達,但是GBP1卻在這些細胞中顯著上調;通過非小細胞肺癌細胞系的進一步基因沉默實驗發(fā)現,沉默PDHA1 48小時后,GBP1的基因和蛋白表達得到顯著上調,而沉默GBP1 48小時后未見PDHA1的表達變化。綜上研究提示PDHA1可以直接或間接參與GBP1的負反饋調節(jié),而PDHA1的低表達和GBP1的高表達是非小細胞肺癌的惡性預后因子。第一部分非小細胞肺癌組織中PDHA1及GBP1表達與臨床病理特征及預后的關系目的探索非小細胞肺癌組織中PDHA1及GBP1蛋白水平表達的臨床意義及與預后的關系。方法1.回顧性分析了2011年1月至2013年12月期間鄭州大學第一附屬醫(yī)院手術切除組織證實為非小細胞肺癌的102例患者的臨床資料。2.采用免疫組化方法檢測癌組織及對應癌旁組織PDHA1及GBP1蛋白的表達。3.分析PDHA1及GBP1蛋白表達與臨床病理特征之間的關系,并對兩種蛋白的表達作出相關性分析。4.隨訪和生存分析,確定PDHA1及GBP1蛋白表達情況、不同分化程度、淋巴結是否轉移、TNM分期對總生存期的影響。結果1.PDHA1蛋白在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率為39.2%(40/102),在對應的癌旁組織中的陽性表達率為82.4%(84/102)。PDHA1蛋白在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率顯著低于癌旁組織(χ~2=39.813,P0.05)。GBP1蛋白在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率為65.7%(67/102),在對應的癌旁組織中的陽性表達率為33.3%(34/102)。GBP1蛋白在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織(χ~2=21.355,P0.05)。2.在非小細胞肺癌組織中,PDHA1蛋白及GBP1蛋白的表達與患者性別、吸煙史及病理類型無關,而與組織分化程度、淋巴結是否轉移及TNM分期有關。PDHA1及GBP1蛋白的表達存在負相關性。3.PDHA1及GBP1蛋白的表達、組織分化程度、淋巴結是否轉移及TNM分期均與非小細胞肺癌預后有關(P0.05)。結論隨著非小細胞肺癌的進展,PDHA1蛋白表達下降,而GBP1蛋白表達升高,并且兩者均可影響預后,可以作為判斷預后的潛在指標。第二部分非小細胞肺癌組織中PDHA1及GBP1 mRNA及蛋白表達水平的檢測及臨床意義目的研究非小細胞肺癌新鮮組織中PDHA1及GBP1 mRNA及蛋白表達水平及其臨床相關意義。方法1.收集20例配對的肺癌及癌旁組織,運用Realtime RT-PCR檢測非小細胞肺癌及癌旁組織PDHA1及GBP1基因mRNA水平的表達情況及二者的相關性分析。2.Western blot檢測非小細胞肺癌及癌旁組織PDHA1及GBP1蛋白的表達情況。結果1.在配對的肺癌標本中,相對于癌旁組織,早期癌PDHA1mRNA表達降低,晚期癌表達更低(P0.05)。早期癌GBP1mRNA表達增高,晚期癌表達更高(P0.05)。兩者呈低度負相關(P0.05)。2.不同TNM分期的非小細胞肺癌及癌旁組織的PDHA1和GBP1蛋白表達存在顯著差異(P0.05)。結論PDHA1低表達和GBP1高表達與非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關,可作為判斷非小細胞肺癌生物學行為的重要參考指標。第三部分缺氧對非小細胞肺癌細胞株PDHA1及GBP1表達的影響目的通過缺氧環(huán)境下對非小細胞肺癌細胞株的培養(yǎng),檢測缺氧、PDHA1及GBP1三者之間的關系及其對惡性表征的影響。方法1.肺鱗癌細胞株LC-42及肺腺癌細胞株SELS分別正常氧(20%O_2)及低氧(1%O_2)條件下培養(yǎng)。2.20%O_2組及1%O_2組兩種肺癌細胞系的細胞形態(tài)學觀察、生長曲線及倍增時間測定。3.Western blot檢測20%O_2組及1%O_2組兩種肺癌細胞系的PDHA1和GBP1蛋白的表達。4.Transwell侵襲實驗檢測20%O_2組及1%O_2組兩種肺癌細胞系的體外侵襲能力。5.克隆形成實驗檢測20%O_2組及1%O_2組兩種肺癌細胞系的體外克隆形成能力。結果1.1%O_2組的兩種肺癌細胞系,細胞均出現生長緩慢,DT延長。20%O_2組及1%O_2組的兩種肺癌細胞系的DT差別均具有統計學意義(P0.05)。2.隨著環(huán)境中氧含量的降低,PDHA1蛋白表達減少,而GBP1蛋白表達增加。20%O_2組及1%O_2組的兩種肺癌細胞系PDHA1和GBP1蛋白表達存在顯著差異(P0.05)。3.Transwell小室侵襲實驗結果顯示:1%O_2組肺鱗癌細胞株LC-42的細胞穿膜數為(3014.6±521.1);20%O_2組的細胞穿膜數為(1837.2±796.4);兩者差異有統計學意義(P0.05)。肺腺癌細胞株SELS在1%O_2組細胞穿膜數為(3812.2±809.9),而在20%O_2組為(1501.7±378.2),兩者差異有統計學意義(P0.05)。4.肺鱗癌細胞株LC-42 20%O_2組克隆形成率為15.6±4.2%,1%O_2組克隆形成率為32.9±6.9%,兩者差異有統計學意義(P0.05)。肺腺癌細胞株SELS 20%O_2組克隆形成率為18.1±5.6%,1%O_2組克隆形成率為36.4±5.6%,兩者差異有統計學意義(P0.05)。結論1.缺氧導致了肺鱗癌及腺癌細胞PDHA1蛋白表達下降,GBP1蛋白表達上調。2.缺氧、PDHA1下調及GBP1上調共同參與了肺鱗癌及腺癌細胞惡性生物學行為增強。第四部分非小細胞肺癌細胞株中PDHA1及GBP1表達相互關系的研究目的通過siRNA基因沉默技術研究抑制PDHA1的基因表達后對GBP1基因和蛋白表達的影響,以及沉默GBP1基因后對PDHA1基因和蛋白表達的影響規(guī)律,從而間接探索二者基因活性的相互關系。方法1.細胞準備:肺鱗癌細胞株LC-42及肺腺癌細胞株SELS,采用6孔細胞培養(yǎng)板,在37℃、5%CO_2、飽和濕度條件下的CO_2培養(yǎng)箱中,用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時至70%細胞融合備用。2.基因沉默使用圣克魯斯生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology)的相關試劑進行。3.細胞經siRNA轉染試劑轉染48小時后,收集樣品。4.對siRNA轉染48小時的細胞采用RT-PCR分析細胞中的PDHA1以及GBP1mRNA的表達。5.對siRNA轉染48小時的細胞采用免疫細胞化學進一步分析細胞中的PDHA1以及GBP1蛋白的表達。6.對siRNA轉染48小時的細胞經Western blot分析細胞中的PDHA1以及GBP1蛋白的表達。結果1.當有效沉默非小細胞肺癌中的PDHA1的表達后,GBP1的基因和蛋白的表達得到有效激活,表達水平顯著上調。2.但是,當有效沉默非小細胞肺癌中的GBP1的表達后,PDHA1的基因和蛋白的表達沒有明顯的差異。3.上述研究結果在LC-42和SELS兩組細胞中結果類似。結論1.GBP1是PDHA1的下游基因。2.PDHA1直接或者間接參與了GBP1基因的負調控。
【圖文】：

圖1.1 NSCLC癌及癌旁組織中PDHA1及GBP1蛋白的表達) PDHA1 在肺鱗癌組織中陽性表達（×400）；) PDHA1 在肺腺癌組織中陽性表達（×200）；) GBP1 在肺鱗癌組織中陽性表達（×400）；) GBP1 在肺腺癌組織中陽性表達（×200）；) PDHA1 在 NSCLC 癌旁組織中陽性表達（×200）；表 1.1 PDHA1 蛋白及 GBP1 蛋白在非小細胞肺癌及癌旁組織的表達組織類型 例數PDHA1蛋白 GBP1蛋白+ - χ2P + - χ2P癌組織 102 40 6239.813 ＜0.0567 3521.355 ＜0癌旁組織 102 84 18 34 68(B) PDHA1 在肺鱗癌組織中弱陽性表達（×400）(D) PDHA1 在肺腺癌組織中弱陽性表達（×400）(F) GBP1 在肺鱗癌組織中弱陽性表達（×400）(H) GBP1 在肺腺癌組織中弱陽性表達（×400）(J) GBP1 在 NSCLC 癌旁組織中陰性表達（×200）

PDHA1陽/陰性表達對NSCLC總生存期的影響
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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本文編號：2694594