發(fā)布時(shí)間：2020-06-02 12:58

【摘要】：背景和目的中性粒細(xì)胞被激活后,其核DNA與胞漿顆粒蛋白一起形成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),即中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil Extracellular Traps,NETs),此過程稱為“NETosis”。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,NETs可以捕獲病原微生物,在固有免疫反應(yīng)中具有重要意義。然而,最新研究顯示,在糖尿病過程中,NETosis會(huì)持續(xù)存在,釋放的NETs阻礙傷口愈合。此外,流行病學(xué)資料顯示,多種腫瘤在糖尿病時(shí)發(fā)病率也明顯升高,那么NETs是否參與糖尿病時(shí)腫瘤的發(fā)生呢?目前尚未見報(bào)道。另外,本實(shí)驗(yàn)室長期以來一直從事硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)的相關(guān)研究,其通過減少活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的生成可發(fā)揮明顯的抗氧化效應(yīng),而ROS在NETosis發(fā)生過程中起著重要作用。那么H2S能否通過減少ROS生成抑制NETosis發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合呢?基于此,本文的研究目的是:1.明確糖尿病足部潰瘍患者體內(nèi)NETs水平;2.建立NETosis體外模型,收集NETs并用其處理腫瘤細(xì)胞,觀察其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;3.觀察H2S對糖尿病傷口愈合障礙的影響,探討其機(jī)制是否與抑制NETosis有關(guān)。方法1.分別收集糖尿病足潰瘍患者和健康志愿者外周血5例,分離血清,檢測ds NDA和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的活性,觀察糖尿病足潰瘍患者血清中NETs成分的含量。2.分離健康志愿者外周血中性粒細(xì)胞,瑞氏-吉姆薩染色后在顯微鏡下初步觀察分離細(xì)胞的形態(tài),進(jìn)一步用APC CD11b抗體標(biāo)記分離的細(xì)胞,流式細(xì)胞分析術(shù)分析中性粒細(xì)胞的純度。3.佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激中性粒細(xì)胞,建立NETosis體外模型。Western blot法檢測NETosis相關(guān)蛋白精氨酸脫亞胺酶4(Peptidylarginine Deiminase 4,PAD-4)和瓜氨酸化組蛋白3(Citrulline Histone 3,Cit-H3)的表達(dá)情況,明確PMA誘導(dǎo)NETosis形成的最適濃度和最佳時(shí)間。4.用25 n M PMA刺激中性粒細(xì)胞2 h,差速離心法提取培養(yǎng)皿底部NETs,通過Western blot法檢測髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP-9)以及NE,并用Pico Green檢測ds DNA含量,從而對提取物進(jìn)行鑒定。5.將提取的NETs與幾種常見腫瘤細(xì)胞(肝癌細(xì)胞SMMC7721、肺癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela)共培養(yǎng)48 h后。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力,觀察NETs對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響;NETs與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后用胰酶消化,接種于96孔板,分別檢測總細(xì)胞和6 h后貼壁細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算細(xì)胞粘附率;將不同濃度的NETs置于Transwell板下室,與上室的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,0.5%結(jié)晶紫染色后用顯微鏡觀察NETs對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。6.在小鼠背部制作直徑為6 mm的全層皮膚傷口,測量計(jì)算小鼠傷口面積,Western blot法檢測傷口組織NETosis和NETs相關(guān)蛋白的表達(dá),探討NETosis對糖尿病小鼠傷口愈合的影響。腹腔注射H2S(以Na2S為供體),通過檢測皮膚傷口面積以及傷口組織ds DNA含量和NE活性,探討H2S促進(jìn)糖尿病小鼠傷口愈合是否與抑制NETosis有關(guān)。7.分離中性粒細(xì)胞,25μM H2S預(yù)處理1 h后再給予25 n M PMA刺激2 h,通過核酸染色從形態(tài)上初步觀察H2S對PMA誘導(dǎo)的NETs釋放的影響,進(jìn)一步檢測培養(yǎng)皿底部NETs成分(ds DNA含量、NE和MPO活性)的變化。通過二氫羅丹明123檢測ROS的含量。最后,通過檢測NETosis相關(guān)蛋白PAD-4和Cit-H3的表達(dá),明確H2S對抗PMA誘導(dǎo)的NETs釋放是否與抑制NETosis有關(guān)。結(jié)果1.糖尿病足潰瘍患者血清ds DNA含量明顯高于健康志愿者(P0.01),其NE活性也高于健康志愿者(P0.05)。2.對分離細(xì)胞用瑞士-吉姆薩染色后在顯微鏡下觀察顯示,細(xì)胞主要為分葉核;流式細(xì)胞術(shù)定量分析顯示,APC CD11b陽性率為99.95%。結(jié)果提示分離得到的細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主,并且中性粒細(xì)胞含量大于95%。3.不同濃度PMA處理中性粒細(xì)胞后,PMA濃度為25 n M時(shí)PAD-4和Cit-H3表達(dá)達(dá)到峰值。在2 h內(nèi),隨著處理時(shí)間延長,PAD-4和Cit-H3的表達(dá)時(shí)間依賴性升高。通過Western blot法檢測提取物顯示,提取物中含有ds DNA、MPO、MMP-9和NE,而且MPO和NE具有催化活性。4.用不同濃度的NETs處理糖尿病過程中常見的三種癌細(xì)胞,檢測細(xì)胞活力顯示,低濃度(0.13μg/ml)NETs處理48 h可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721增殖,而對另外兩種細(xì)胞無明顯影響。進(jìn)一步檢測NETs對SMMC7721細(xì)胞粘附和遷移能力的影響,結(jié)果顯示,NETs可明顯增強(qiáng)SMMC7721細(xì)胞的粘附和遷移功能(P0.05);當(dāng)NETs濃度過高時(shí),對各種腫瘤細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用,也能明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC7721的粘附能力和遷移能力(P0.05)。5.通過觀察傷口的愈合狀況發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠傷口愈合率明顯低于對照組(P0.01);另外,糖尿病小鼠傷口組織NETosis相關(guān)蛋白PAD-4和Cit-H3表達(dá)明顯高于對照組,NETs成分MPO和NE也高于對照組。重要的是,給予H2S治療后,糖尿病小鼠皮膚傷口愈合率明顯高于模型組(P0.01);并且皮膚傷口組織ds DNA含量減少(P0.05),并且NE活性降低(P0.05)。6.在PMA誘導(dǎo)的NETosis體外模型發(fā)現(xiàn),PMA可促進(jìn)纖維網(wǎng)狀ds DNA釋放,上調(diào)NE和MPO活性(P0.05),以及ROS釋放(P0.05),促進(jìn)NETosis相關(guān)蛋白PAD-4和Cit-H3的表達(dá)(P0.05)。重要的是,H2S預(yù)處理1 h,PMA誘導(dǎo)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失,NE和MPO活性降低(P0.05),ROS含量減少,并且NETosis相關(guān)蛋白PAD-4和Cit-H3的表達(dá)也減少(P0.05)。結(jié)論本研究證實(shí),糖尿病可致中性粒細(xì)胞釋放NETs,這些NETs可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、粘附和遷移,阻礙糖尿病傷口愈合。H2S處理可抑制NETosis的發(fā)生和NETs釋放,從而改善糖尿病傷口愈合。本研究為以NETs為靶點(diǎn)的糖尿病皮膚并發(fā)癥和肝癌發(fā)生提供了新的治療思路。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 糖尿病足潰瘍患者血清 NETs 高于正常人NETs 是以 DNA 為骨架，鑲嵌有胞漿蛋白如 NE 等構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。收集臨床糖尿病足潰瘍患者外周血，分離血清，利用 PicoGreen 與 dsDNA 結(jié)合發(fā)出熒光，檢測 520/480 nm 熒光值，表示血清 dsDNA 含量。結(jié)果如圖 1（A）所示，與對照組相比，糖尿病足潰瘍患者血清 dsDNA 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。進(jìn)一步檢測 NE 活性，如圖 1（B）所示，糖尿病足潰瘍患者血清 NE 活性比對照組更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。結(jié)果表明糖尿病足潰瘍患者外周血清 NETs 含量高于正常人。

圖 2 中性粒細(xì)胞的分離純化及鑒定收集健康志愿者外周血，用梯度離心法提取中性粒細(xì)胞，圖 A 瑞氏-吉姆薩染色法觀察分離細(xì)胞的形態(tài)（放大倍數(shù) 100×），圖 B 用熒光 APC 標(biāo)記的單克隆抗體 CD11b 標(biāo)記中性粒細(xì)胞，流式細(xì)胞分析術(shù)定量分析分離中性粒細(xì)胞的數(shù)量及百分比。3. 在體外用 PMA 誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生 NETosis3.1 不同濃度的 PMA 對中性粒細(xì)胞釋放 NETs 的影響分離的中性粒細(xì)胞，用顯微鏡觀察明場，對照組中性粒細(xì)胞呈圓形，邊緣光滑；PMA 刺激后中性粒細(xì)胞邊緣不規(guī)則化，細(xì)胞整體變得扁平；使用 Hoechst33258 死細(xì)胞核酸進(jìn)行熒光染色分析，對照組被染上藍(lán)色熒光細(xì)胞少，加入 PMA 后被染色藍(lán)色熒光細(xì)胞增多，細(xì)胞核膨大，細(xì)胞間形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，如圖 3。結(jié)果提示 PMA能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放 NETs，，而且隨著 PMA 濃度增大中性粒細(xì)胞形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 朱明昂;曹清;莫茜;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)及其在相關(guān)疾病中的作用[J];國際免疫學(xué)雜志;2016年01期

2 張樂蒙;羅永忠;周輝;王偉;姚定泉;文曉萍;楊華;陳建華;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與腫瘤及其相關(guān)性疾病的研究進(jìn)展[J];腫瘤藥學(xué);2015年06期

3 唐亞尼;孫洋;葉茂;;炎癥反應(yīng)促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué)研究;2015年02期

4 馮瑞祥;盧坤剛;張紅燁;陸金春;;精液中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的研究進(jìn)展[J];中華男科學(xué)雜志;2011年11期

5 周劍濤;丁海峰;夏瑾燕;;組蛋白瓜氨酸化介導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成[J];生命的化學(xué);2009年04期

6 杜軍保,陳曉波,耿彬,蔣宏峰,唐朝樞;硫化氫作為心血管信號分子的研究[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年02期

本文編號：2693193