【摘要】：第一部分結(jié)直腸癌相關(guān)pi RNAs的篩選背景和目的:結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率非常高,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。Piwi蛋白相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs,piRNAs)是一類(lèi)新穎的非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs),在多種腫瘤中異常表達(dá)。但結(jié)直腸癌中piRNA表達(dá)譜的變化尚無(wú)報(bào)道。本部分研究旨在了解結(jié)直腸癌中piRNA表達(dá)譜的改變,并篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)piRNAs。方法:應(yīng)用深度測(cè)序技術(shù)探討結(jié)直腸癌和癌旁組織中piRNA表達(dá)譜的差異,并篩選結(jié)直腸癌相關(guān)piRNAs。應(yīng)用real-time PCR技術(shù)對(duì)篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)piRNAs進(jìn)行驗(yàn)證,并觀察這些piRNAs表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果:深度測(cè)序結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌和癌旁組織中piRNAs的種類(lèi)分別占小ncRNAs的0.17‰和0.23‰,其表達(dá)分別占0.11‰和0.08‰。盡管結(jié)直腸癌和癌旁組織中pi RNAs的表達(dá)非常低,但卻存在明顯差異,其總體表達(dá)在結(jié)直腸癌中上調(diào)。我們總共篩選出33個(gè)在結(jié)直腸癌中上調(diào)的piRNAs,2個(gè)下調(diào)的piRNAs。其中,piR-18849、piR-19521和piR-17724是3個(gè)上調(diào)最明顯的piRNAs。Real-time PCR進(jìn)一步證實(shí)了piR-18849、piR-19521和piR-17724在80例結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于其配對(duì)的癌旁組織。此外,piR-18849的表達(dá)與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),piR-19521的表達(dá)僅與腫瘤的分化程度相關(guān)。而piR-17724的表達(dá)與患者的臨床病理特征之間沒(méi)有相關(guān)性。結(jié)論:pi RNAs的總體表達(dá)在結(jié)直腸癌中上調(diào),其可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。piR-18849和piR-19521有望成為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)。第二部分結(jié)直腸癌相關(guān)pi R-19521增加結(jié)直腸癌干細(xì)胞樣特性背景和目的:復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者高病死率的主要原因。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是啟動(dòng)腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長(zhǎng)、導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源,根除CSCs將有望降低結(jié)直腸癌患者的病死率。piRNAs參與生殖干細(xì)胞干性的維持,而CSCs與生殖干細(xì)胞具有相似的特性,提示piRNAs可能也參與調(diào)控CSCs的功能。然而pi RNAs是否參與結(jié)直腸癌干細(xì)胞(colorectal cancer stem cell,CRCSC)樣特性的調(diào)控,目前尚不清楚。本部分研究旨在明確第一部分篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)piRNA piR-19521是否調(diào)控CRCSC樣特性。方法:首先應(yīng)用real-time PCR技術(shù)在結(jié)直腸癌組織中觀察piR-19521表達(dá)與CRCSC標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系。然后應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)法從3種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中富集CRCSCs,觀察piR-19521在CRCSCs和相應(yīng)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異。最后在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)piR-19521,在CRCSCs中抑制piR-19521,從體內(nèi)、體外水平觀察piR-19521對(duì)CRCSC樣特性的影響。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中piR-19521的表達(dá)與CRCSC標(biāo)志物CD29、CD133、CD166和Lgr5的表達(dá)呈正相關(guān)。piR-19521在CRCSCs中的表達(dá)顯著高于結(jié)直腸癌細(xì)胞。過(guò)表達(dá)piR-19521促進(jìn)CRCSC標(biāo)志物與胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2的表達(dá),增加CRCSC亞群的比例。過(guò)表達(dá)piR-19521促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成、遷移和侵襲,同時(shí)也促進(jìn)細(xì)胞的體內(nèi)成瘤及肝轉(zhuǎn)移。然而,抑制pi R-19521抑制CRCSC標(biāo)志物和SOX2的表達(dá),降低CRCSC亞群的比例。此外,抑制piR-19521降低CRCSCs的腫瘤起始和自我更新能力,抑制CRCSCs的體內(nèi)成瘤及肝轉(zhuǎn)移。結(jié)論:結(jié)直腸癌相關(guān)piR-19521在CRCSCs中表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)CRCSC樣特性的獲得,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移,其有望成為結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)。第三部分piR-19521通過(guò)促進(jìn)ALX4表達(dá)增加結(jié)直腸癌干細(xì)胞樣特性背景和目的:上一部分研究結(jié)果表明piR-19521調(diào)控CRCSC樣特性,但參與這一過(guò)程的分子機(jī)制目前尚不清楚。本部分研究旨在闡明piR-19521調(diào)控CRCSC樣特性的機(jī)制。方法:應(yīng)用數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling,DGE)技術(shù),篩選piR-19521調(diào)控CRCSC樣特性的靶基因,并在細(xì)胞水平對(duì)靶基因的表達(dá)和功能進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)闡明piR-19521調(diào)控該靶基因表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果:DGE測(cè)序結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)piR-19521導(dǎo)致899個(gè)基因表達(dá)上調(diào),662個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。GO功能分析和Reactome通路分析表明這些差異表達(dá)的基因參與細(xì)胞的多種生物過(guò)程,包括與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管形成以及細(xì)胞連接等生物過(guò)程。我們篩選出了piR-19521的靶基因ALX4,并進(jìn)一步證實(shí)過(guò)表達(dá)piR-19521促進(jìn)ALX4的表達(dá),抑制piR-19521抑制ALX4的表達(dá)。CRCSCs中ALX4的表達(dá)顯著高于結(jié)直腸癌細(xì)胞。在HCT116細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ALX4促進(jìn)CRCSC標(biāo)志物和SOX2的表達(dá),增加CRCSC亞群的比例。補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)ALX4可抵抗piR-19521抑制導(dǎo)致的干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的下降和自我更新能力的降低。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中piR-19521來(lái)源于活性增強(qiáng)子元件。piR-19521通過(guò)調(diào)控其基因座附近區(qū)域H3K27ac標(biāo)記的富集提高增強(qiáng)子的活性。結(jié)論:piR-19521通過(guò)上調(diào)ALX4表達(dá)增加CRCSC樣特性。首次表明piR-19521可調(diào)控增強(qiáng)子的活性,具有增強(qiáng)子RNAs的功能。
【圖文】：

圖 1 結(jié)直腸癌和癌旁樣本中小 ncRNAs 的總體差異.1 The overall difference of small ncRNAs in colorectal cancer sampand adjacent samplesenn chart shows the species of small ncRNAs in colorectal cmples (T) and adjacent samples (N).enn chart shows the reads counts of small ncRNAs in colorectal cmples (T) and adjacent samples (N).

圖 2 結(jié)直腸癌和癌旁樣本中各類(lèi)小 ncRNAs 的種數(shù)和表達(dá)Fig.2 Species number and reads counts of various types of small ncRNAs incolorectal cancer samples and adjacent samplesA. Pie charts show the species of various types of small ncRNAs in colorectalcancer samples and adjacent samples.B. Pie charts show the reads counts of various types of small ncRNAs incolorectal cancer samples and adjacent samples.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2692693