發(fā)布時間：2020-06-02 05:41

【摘要】：第一部分結(jié)直腸癌相關(guān)pi RNAs的篩選背景和目的:結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率非常高,嚴重威脅著人類健康。Piwi蛋白相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs,piRNAs)是一類新穎的非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs),在多種腫瘤中異常表達。但結(jié)直腸癌中piRNA表達譜的變化尚無報道。本部分研究旨在了解結(jié)直腸癌中piRNA表達譜的改變,并篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)piRNAs。方法:應用深度測序技術(shù)探討結(jié)直腸癌和癌旁組織中piRNA表達譜的差異,并篩選結(jié)直腸癌相關(guān)piRNAs。應用real-time PCR技術(shù)對篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)piRNAs進行驗證,并觀察這些piRNAs表達與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果:深度測序結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌和癌旁組織中piRNAs的種類分別占小ncRNAs的0.17‰和0.23‰,其表達分別占0.11‰和0.08‰。盡管結(jié)直腸癌和癌旁組織中pi RNAs的表達非常低,但卻存在明顯差異,其總體表達在結(jié)直腸癌中上調(diào)。我們總共篩選出33個在結(jié)直腸癌中上調(diào)的piRNAs,2個下調(diào)的piRNAs。其中,piR-18849、piR-19521和piR-17724是3個上調(diào)最明顯的piRNAs。Real-time PCR進一步證實了piR-18849、piR-19521和piR-17724在80例結(jié)直腸癌組織中的表達高于其配對的癌旁組織。此外,piR-18849的表達與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),piR-19521的表達僅與腫瘤的分化程度相關(guān)。而piR-17724的表達與患者的臨床病理特征之間沒有相關(guān)性。結(jié)論:pi RNAs的總體表達在結(jié)直腸癌中上調(diào),其可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。piR-18849和piR-19521有望成為結(jié)直腸癌患者預后的指標。第二部分結(jié)直腸癌相關(guān)pi R-19521增加結(jié)直腸癌干細胞樣特性背景和目的:復發(fā)和轉(zhuǎn)移是導致結(jié)直腸癌患者高病死率的主要原因。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是啟動腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長、導致腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源,根除CSCs將有望降低結(jié)直腸癌患者的病死率。piRNAs參與生殖干細胞干性的維持,而CSCs與生殖干細胞具有相似的特性,提示piRNAs可能也參與調(diào)控CSCs的功能。然而pi RNAs是否參與結(jié)直腸癌干細胞(colorectal cancer stem cell,CRCSC)樣特性的調(diào)控,目前尚不清楚。本部分研究旨在明確第一部分篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)piRNA piR-19521是否調(diào)控CRCSC樣特性。方法:首先應用real-time PCR技術(shù)在結(jié)直腸癌組織中觀察piR-19521表達與CRCSC標志物表達之間的關(guān)系。然后應用無血清培養(yǎng)法從3種結(jié)直腸癌細胞系中富集CRCSCs,觀察piR-19521在CRCSCs和相應腫瘤細胞中的表達差異。最后在結(jié)直腸癌細胞系中過表達piR-19521,在CRCSCs中抑制piR-19521,從體內(nèi)、體外水平觀察piR-19521對CRCSC樣特性的影響。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中piR-19521的表達與CRCSC標志物CD29、CD133、CD166和Lgr5的表達呈正相關(guān)。piR-19521在CRCSCs中的表達顯著高于結(jié)直腸癌細胞。過表達piR-19521促進CRCSC標志物與胚胎干細胞標志物SOX2的表達,增加CRCSC亞群的比例。過表達piR-19521促進結(jié)直腸癌細胞克隆形成、遷移和侵襲,同時也促進細胞的體內(nèi)成瘤及肝轉(zhuǎn)移。然而,抑制pi R-19521抑制CRCSC標志物和SOX2的表達,降低CRCSC亞群的比例。此外,抑制piR-19521降低CRCSCs的腫瘤起始和自我更新能力,抑制CRCSCs的體內(nèi)成瘤及肝轉(zhuǎn)移。結(jié)論:結(jié)直腸癌相關(guān)piR-19521在CRCSCs中表達上調(diào),并促進CRCSC樣特性的獲得,從而促進腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移,其有望成為結(jié)直腸癌治療的新靶點。第三部分piR-19521通過促進ALX4表達增加結(jié)直腸癌干細胞樣特性背景和目的:上一部分研究結(jié)果表明piR-19521調(diào)控CRCSC樣特性,但參與這一過程的分子機制目前尚不清楚。本部分研究旨在闡明piR-19521調(diào)控CRCSC樣特性的機制。方法:應用數(shù)字基因表達譜(digital gene expression profiling,DGE)技術(shù),篩選piR-19521調(diào)控CRCSC樣特性的靶基因,并在細胞水平對靶基因的表達和功能進行驗證。應用生物信息學和分子生物學技術(shù)闡明piR-19521調(diào)控該靶基因表達的分子機制。結(jié)果:DGE測序結(jié)果顯示,過表達piR-19521導致899個基因表達上調(diào),662個基因表達下調(diào)。GO功能分析和Reactome通路分析表明這些差異表達的基因參與細胞的多種生物過程,包括與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞增殖、細胞凋亡、血管形成以及細胞連接等生物過程。我們篩選出了piR-19521的靶基因ALX4,并進一步證實過表達piR-19521促進ALX4的表達,抑制piR-19521抑制ALX4的表達。CRCSCs中ALX4的表達顯著高于結(jié)直腸癌細胞。在HCT116細胞中過表達ALX4促進CRCSC標志物和SOX2的表達,增加CRCSC亞群的比例。補救實驗結(jié)果表明,過表達ALX4可抵抗piR-19521抑制導致的干細胞標志物表達的下降和自我更新能力的降低。在結(jié)直腸癌細胞中piR-19521來源于活性增強子元件。piR-19521通過調(diào)控其基因座附近區(qū)域H3K27ac標記的富集提高增強子的活性。結(jié)論:piR-19521通過上調(diào)ALX4表達增加CRCSC樣特性。首次表明piR-19521可調(diào)控增強子的活性,具有增強子RNAs的功能。
【圖文】：

圖 1 結(jié)直腸癌和癌旁樣本中小 ncRNAs 的總體差異.1 The overall difference of small ncRNAs in colorectal cancer sampand adjacent samplesenn chart shows the species of small ncRNAs in colorectal cmples (T) and adjacent samples (N).enn chart shows the reads counts of small ncRNAs in colorectal cmples (T) and adjacent samples (N).

圖 2 結(jié)直腸癌和癌旁樣本中各類小 ncRNAs 的種數(shù)和表達Fig.2 Species number and reads counts of various types of small ncRNAs incolorectal cancer samples and adjacent samplesA. Pie charts show the species of various types of small ncRNAs in colorectalcancer samples and adjacent samples.B. Pie charts show the reads counts of various types of small ncRNAs incolorectal cancer samples and adjacent samples.
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

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本文編號：2692693