【摘要】：目的:本研究主要通過構(gòu)建并包裝干擾人肝癌衍生生長因子(human hepatoma-derived growth factor,hHDGF)表達(dá)的短發(fā)卡 RNA(short haircut RNA,shRNA)慢病毒,在體外條件下探究下調(diào)HDGF表達(dá)水平對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,并進(jìn)一步探討其潛在的可能機(jī)制,為闡明前列腺癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)理和探尋前列腺癌新的臨床診斷和治療方法及預(yù)后判斷指標(biāo)提供新的線索和方向。方法:根據(jù)hHDGF的干擾靶點(diǎn)構(gòu)建干擾HDGF表達(dá)的shRNA及其對應(yīng)的含無意義序列的shRNA,包裝成慢病毒并純化后轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞株DU145、PC3和LNCaP,并用含嘌呤霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。每種細(xì)胞分為3組:①空白對照組(PBS):PBS處理細(xì)胞;②陰性對照組(shRNA-CTR):含無意義序列的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞;③實(shí)驗(yàn)組(shRNA-HDGF):含靶序列的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后,運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測hHDGF mRNA表達(dá)水平,CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞生長和增殖能力,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力,Western blotting檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,包括PI3K-AKT-mTOR信號通路中的相關(guān)蛋白、與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關(guān)的相關(guān)蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloproteinases,MMPs)中MMP2、MMP9等。結(jié)果:成功構(gòu)建干擾HDGF表達(dá)的慢病毒載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的前列腺癌細(xì)胞株,qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示hHDGF mRNA和蛋白表達(dá)均被抑制(P0.05),CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示細(xì)胞生長和增殖能力下降(P0.05),細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)均顯示細(xì)胞遷移能力下降(P0.05),Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)示細(xì)胞侵襲能力下降(P0.05),Western blotting示P13K-AKT-mTOR信號通路中的相關(guān)蛋白磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(P-AKT)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(P-mTOR)表達(dá)均下降(P均0.05),與EMT有關(guān)的N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snai和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)也均下降(P均0.05),而E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)升高(P0.05)。另外,Western blotting還發(fā)現(xiàn),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)中MMP2、MMP9的表達(dá)也下降(P0.05)。結(jié)論:HDGF表達(dá)下調(diào)對前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力具有抑制作用,而且該抑制作用可能與PI3K-AKT-mTOR信號通路失活、EMT被抑制及MMP2、MMP9的表達(dá)水平下降有關(guān)。
【圖文】：

圖１重組質(zhì)粒驗(yàn)證與慢病毒ＧＦＰ熒光檢測逡逑Ａ：重組質(zhì)粒ＧＰＨ－ｈＨＤＧＦ－ＳＨｌ邋ｆｃｏＲ邋Ｉ、Ｉ雙酶切驗(yàn)證電泳圖。Ｍｌ：逡逑ＧＰＨ－ｈＨＤＧＦ－ＳＨｌ邋質(zhì)粒；Ｍ２邋？Ｍ４：邋ＧＰＨ－ｈＨＤＧＦ－ＳＨｌ邋酶切；Ｍ５：邋ＤＮＡＭａｒｋ２０００；邋Ｍ６：邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋１５０００。Ｂ、Ｃ：慢病毒轉(zhuǎn)染２９３Ｔ細(xì)胞ＧＦＰ熒光檢測（Ｂ為明場照片，Ｃ為熒光視野照片，放大倍數(shù)均為ｘｌＯＯ）。逡逑

圖２慢病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞后對ＨＤＧＦ邋ｍＲＮＡ和蛋白水平表達(dá)的影響逡逑Ａ：前列腺癌細(xì)胞系（ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ）邋ｓｈＲＮＡ－ＨＤＧＦ邋組邋ｓｈＲＮＡ邋干逡逑擾序列和邋ｓｈＲＮＡ－ＣＴＲ組ｓｈＲＮＡ干擾序列。ｓｈＲＮＡ－ＨＤＧＦ邋：逡逑５邋（－Ａ邋ＡＣＣＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＡ－３ｓｈＲＮＡ－ＣＴＲ邐：逡逑５＇－ＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ－３＇。Ｂ：熒光倒置顯微鏡下前列腺癌細(xì)胞系慢病逡逑毒轉(zhuǎn)染效率示意圖（放大倍數(shù)：Ｘ２００）。ＤＵ１４５和ＰＣ３細(xì)胞均以ＭＯＩ＝５０轉(zhuǎn)染，逡逑２４ｈ后轉(zhuǎn)染效率達(dá)９０％以上，ＬＮＣａＰ細(xì)胞以ＭＯＩ＝２０轉(zhuǎn)染，３６ｈ后轉(zhuǎn)染效率達(dá)９０％逡逑以上。Ｃ：邋ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果分析示ＨＤＧＦ邋ｍＲＮＡ水平在前列腺癌細(xì)胞系逡逑２８逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周世杰;許紹發(fā);張海青;劉志東;;肝癌衍生生長因子在Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J];中華腫瘤雜志;2007年12期

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本文編號：2691136