【摘要】：目的:基因組的穩(wěn)定性對生命體的生長、發(fā)育、代謝、疾病有著重要意義。近些年,越來越多的癌癥被發(fā)現(xiàn)與基因組不穩(wěn)定有直接關(guān)系。這主要是因?yàn)榧?xì)胞發(fā)生DNA損傷時(shí),細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制發(fā)生異常,基因組變的不穩(wěn)定,促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在臨床診療和研究過程中,研究人員還發(fā)現(xiàn)部分腫瘤細(xì)胞可以通過DNA損傷修復(fù)對放化療產(chǎn)生耐受性,導(dǎo)致患者生存率降低和不良預(yù)后。所以,DNA損傷修復(fù)機(jī)制的研究已成為近年來腫瘤的發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)和治療等領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。在長期的研究過程中,人們發(fā)現(xiàn)模塊化的BRCA1羧基末端(BRCT)結(jié)構(gòu)域經(jīng)常出現(xiàn)在DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR)涉及的蛋白質(zhì)中,比如MDC1,TP53BP1,PARP1,BARD1等,它可以作為單個(gè)或串聯(lián)結(jié)構(gòu)域(tBRCT)存在結(jié)合被磷酸化的多肽。ECT2(epithelial cell transforming 2)是一種含BRCT的蛋白質(zhì),也是一種小GTPases的鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF),之前研究最多的是其在細(xì)胞分裂中的功能。ECT2是否能夠參與DNA損傷修復(fù)有待于更深入的研究。方法:通過染色質(zhì)組分分離以及激光切割,免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)探究ECT2能否募集到DNA雙鏈損傷位點(diǎn)。藥物處理并用波長365 nm激光切割穩(wěn)定表達(dá)GFP-ECT2的細(xì)胞,檢測ECT2的募集受什么途徑影響。接著,我們用HR-DRGFP和NHEJ-GFP系統(tǒng)研究ECT2對HR和NHEJ兩種修復(fù)途徑修復(fù)效率的影響,進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然后,我們再利用免疫熒光和波長365 nm激光切割細(xì)胞檢測敲低ECT2對BRCA1 foci和KU70募集的影響,側(cè)面驗(yàn)證HR-DRGFP和NHEJ-GFP的結(jié)果。利用免疫親和純化、銀染和質(zhì)譜分析鑒定出ECT2的相互作用蛋白。最后通過平板克隆形成以及MTS實(shí)驗(yàn),檢測DNA損傷下細(xì)胞的增殖及存活。結(jié)果:1、ECT2能夠募集到DNA雙鏈損傷位點(diǎn)。2、ECT2在DNA雙鏈損傷位點(diǎn)的募集是依賴于PARP1的。3、敲低ECT2能同時(shí)降低HR和NHEJ的修復(fù)效率,并且抑制了DNA損傷位點(diǎn)處BRCA1和KU70的募集。4、ECT2與PARP1,BLM,KU70,KU80,RAD50,BRCA1等HR和NHEJ兩種修復(fù)途徑的關(guān)鍵蛋白都存在相互作用。5、ECT2使細(xì)胞對基因毒性的耐受性增強(qiáng)。結(jié)論:ECT2是依賴于PARP1募集到DNA雙鏈斷裂損傷位點(diǎn)的。且ECT2能夠影響B(tài)RCA1和KU70的招募,最終從HR和NHEJ兩種途徑參與DNA損傷修復(fù)。ECT2還能夠促進(jìn)宮頸腫瘤細(xì)胞在DNA損傷條件下的存活和增殖,綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)ECT2在DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)中的起到非常重要的作用,從而維持基因組的穩(wěn)定,提示我們ECT2可能作為腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

10）DAPI 染核封片，將八小孔培養(yǎng)皿撬開只留底部的玻璃片，將 DAPI 滴在小孔上，用蓋玻片輕輕抹勻后蓋上，注意不能產(chǎn)生氣泡。玻璃趴片只需在載玻片上滴好 DAPI，再將趴片倒蓋在 DAPI 上即可。封好的片子，4 ℃避光保存；11）用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照，整理結(jié)果。1.2 結(jié)果1.2.1 ECT2 能夠在 DNA 損傷時(shí)富集到染色質(zhì)上為了探究 ECT2 在 DDR 中的作用，我們使用了 ER-AsiSI 系統(tǒng)，該系統(tǒng)的優(yōu)勢是在 4-羥基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen, 4-OHT）的處理下，能夠引發(fā)限制性核酸內(nèi)切酶 AsiSI 被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移入核，從而導(dǎo)致 DSBs，再通過 Western-blotting檢測了發(fā)生 DSB 的標(biāo)志蛋白 H2AX，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)在加 4-OHT 處理后， H2AX 的蛋白表達(dá)水平明顯升高（圖 1A），表明系統(tǒng)的高效可行。隨后通過不同時(shí)長的4-OHT 處理細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞組分分離染色質(zhì)蛋白，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng) AsiSI 造成 DSBs后，ECT2 在染色質(zhì)上發(fā)生了富集（圖 1B）。

津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、ECT2 能夠募集到 DNA 雙鏈斷裂損用時(shí)間梯度的 4-OHT 處理，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞組分分離，將染色質(zhì)蛋estern-blotting 檢測染色質(zhì)上 ECT2 的蛋白水平。.2.2 ECT2 能夠募集到 DNA 損傷位點(diǎn)為了充分驗(yàn)證上述結(jié)論的可靠性，我們又利用蔡司 PALM MicroBe光顯微切割系統(tǒng)對 HeLa 細(xì)胞進(jìn)行了激光切割，切割后立即固定細(xì)胞，熒光實(shí)驗(yàn)，染 ECT2 和 H2AX，發(fā)現(xiàn)被激光劃過的細(xì)胞中間出現(xiàn)一條CT2 的富集形成的亮線，且 ECT2 和 H2AX 有共定位（圖 2），說明當(dāng) 損傷時(shí)，ECT2 迅速的在損傷位點(diǎn)發(fā)生了富集，并且在持續(xù)近半個(gè)小時(shí)沒有出現(xiàn)變?nèi)醯嫩E象，至于為何蛋白會富集如此長時(shí)間，還有待于進(jìn)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2

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本文編號：2691088