【摘要】：【目的】肝癌作為世界上最常見的實(shí)體腫瘤之一,其死亡的概率僅次于胃癌和食管癌,位居世界第三位。肝癌的發(fā)生發(fā)展與許多因素有關(guān),但常見的病因主要包括乙型及丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素等。近年來(lái)有研究表明,許多基因的表達(dá)及活性的改變可能影響肝癌的發(fā)生發(fā)展,其中就包括微小RNA(microRNA,miRNA)。miRNA是一類非編碼的單鏈小分子RNA,其大小約22nt。miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后水平或轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá),參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等。近期的研究表明,許多miRNA通過調(diào)節(jié)其靶基因參與腫瘤細(xì)胞的調(diào)控,間接發(fā)揮類似癌基因或是抑癌基因的功能。RAB3B是RAS家族中的一員,是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要參與者。近期有報(bào)道稱其可能與腫瘤的發(fā)展有關(guān)。然而,關(guān)于RAB3B對(duì)肝癌細(xì)胞的惡性行為的影響尚不明確。本研究主要探討RAB3B在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其上下游調(diào)控機(jī)制,為今后肝癌的分子診斷及治療研究可能提供一個(gè)新的角度�！痉椒ā渴紫任覀兝脤�(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了miR-92a在人正常肝臟細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的mRNA水平,隨后在肝癌細(xì)胞QGY-7703和HepG2細(xì)胞中,通過過表達(dá)或封閉miR-92a,利用集落形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-92a對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響,并用western blot檢測(cè)了EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)差異;同時(shí)通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出了miR-92a可能的靶基因——RAB3B,并利用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-92a與RAB3B的直接靶定作用,通過實(shí)時(shí)定量PCR和western blot技術(shù)驗(yàn)證了miR-92a對(duì)RAB3B的直接調(diào)控作用以及可能存在的調(diào)控方式。隨后利用RNA干擾技術(shù),結(jié)合上述表型實(shí)驗(yàn)分析RAB3B過表達(dá)后或敲降后細(xì)胞表型的變化,研究RAB3B的具體功能。最后,我們將與RAB3B的相互作用蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析,并檢測(cè)了其對(duì)ATP生成的影響�！窘Y(jié)果】在前期我們進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,結(jié)果顯示miR-92a在肝癌細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào),而過度表達(dá)miR-92a后,可以看出肝癌細(xì)胞QGY-7703和HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞增殖能力也得到提高,并且使上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少,間皮細(xì)胞分子標(biāo)志物Vimentin表達(dá)增加。通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了miR-92a發(fā)揮作用的直接靶基因?yàn)镽AB3B,并通過深入研究RAB3B的功能后發(fā)現(xiàn),過表達(dá)RAB3B表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng),且能夠促進(jìn)EMT過程。實(shí)時(shí)定量PCR和western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)或是封閉miR-92a可以減少或升高RAB3B的mRNA和蛋白表達(dá)水平。進(jìn)行相互作用蛋白質(zhì)譜分析后發(fā)現(xiàn)RAB3B可能與ATP合成有關(guān),過表達(dá)RAB3B可以增加ATP的生成。【結(jié)論】RAB3B可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),它受miR-92a的調(diào)控,并可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖以及遷移和侵襲的能力,且參與到EMT的進(jìn)程中,同時(shí)還可以促進(jìn)ATP的合成。
【圖文】：

-cadherin 蛋白、Vimentin 蛋白和 GAPD抗體的 Blotto 中，，4℃孵育過夜。TBST 洗膜 20min，將膜放入含有 HRP 標(biāo)孵育 2h，然后用 1×TBST 洗膜 20min。estern LingtningTMChemiluminescence R光盒中，置于暗室曝光，得到的顯色條描，分析各組目的條帶的亮度值。比較各e PCR 檢測(cè)肝癌細(xì)胞中 miR-92a 的表達(dá)情人正常肝臟細(xì)胞 LO2 細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞 ，通過 Real-time PCR 方法檢測(cè)了 miR-9胞中，miR-92a 水平均高于正常肝臟細(xì)胞呈現(xiàn)一個(gè)高表達(dá)的狀態(tài)。

計(jì)算方法為:熒光場(chǎng)中帶有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/明場(chǎng)全部細(xì)胞數(shù)×100%。結(jié)果如圖1-2 所示，QGY-7703 的轉(zhuǎn)染效率約為 75%，HepG2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為 60%明場(chǎng) 熒光場(chǎng)圖 1-2 檢測(cè)兩種肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率1.2.4 實(shí)時(shí)定量 PCR 方法檢測(cè) QGY-7703 和 HepG2 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3/miR-92a 或 ASO-miR-92a 后 miR-92a 的表達(dá)情況在 QGY-7703 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入 pcDNA3/miR-92a 相較于 pcDNA3 的 miR-92a表達(dá)水平升高了約 9.16 倍，而轉(zhuǎn)染合成 ASO-miR-92a 與對(duì)照組相比,miR-92a 的表達(dá)水平下降了 24%。在 HepG2 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染 pcDNA3/miR-92a 相較于 pcDNA3的 miR-92a 表達(dá)水平升高了約 4.30 倍，而轉(zhuǎn)染 ASO-miR-92a 與對(duì)照組相比,miR-92a 的表達(dá)水平下降了 30%。結(jié)果如圖 1-3 示。QGY-7703HepG2
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2690174