發(fā)布時間：2020-05-31 20:06

【摘要】：［目的］結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤(ENKTL)是常見的侵襲性惡性腫瘤之一,約占我國淋巴瘤的6.02%,但發(fā)病原因目前尚未明確。根據(jù)腫瘤患者的染色體核型、基因拷貝數(shù)和基因表達(dá)譜結(jié)果顯示:部分抑癌基因參與了NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究在前期構(gòu)建的NKp46-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)上,探究抑癌基因Foxo1、PTEN、SHP-1及染色體13q14在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生過程中是否發(fā)揮關(guān)鍵作用。該研究主要分為以下三個部分:第一部分:抑癌基因Foxo1和PTEN在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生中的作用探索［方法］1.利用NKp46-iCre小鼠與ROSA26-YFP~(loxP/stop/loxP)[ROSA26-YFP(+/+)]小鼠交配,得到NKp46-iCre;ROSA26-YFP(+/-)小鼠,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組織器官中YFP陽性細(xì)胞的百分比及脾臟中各淋巴細(xì)胞系中YFP陽性細(xì)胞的百分比;2.利用NKp46-iCre小鼠分別與Foxo1~(fl/fl)、PTEN~(fl/fl)小鼠交配,得到NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)PTEN~(fl/fl)(Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK))小鼠,即NK細(xì)胞內(nèi)特異性敲除Foxo1和PTEN的小鼠,連續(xù)觀察小鼠的生長發(fā)育和成瘤情況;利用流式細(xì)胞術(shù),檢測NK細(xì)胞內(nèi)Foxo1和PTEN雙基因缺失后小鼠主要淋巴器官內(nèi)的NK細(xì)胞的比例變化;3.利用B16F10惡性黑色素瘤移植瘤小鼠模型,觀察小鼠NK細(xì)胞內(nèi)Foxo1和PTEN雙基因缺失后對NK細(xì)胞的腫瘤免疫監(jiān)視功能的影響。［結(jié)果］1.與對照組NKp46-iCre;ROSA26-YFP(-/-)小鼠相比,NKp46-iCre;ROSA26-YFP(+/-)小鼠的外周血、淋巴結(jié)、骨髓、脾臟中YFP表達(dá)的陽性細(xì)胞的百分比明顯升高[(BL:8.03%±1.64%vs 0.01%±0.008%)、(LN:0.26%±0.03%vs 0.01%±0.001%)、(BM:1.37%±0.003%vs 0.003%±0.001%)(SP:2.59%±0.67%vs 0.029%±0.013%)],(n=5,P0.05);兩組小鼠非免疫器官心臟中YFP均無明顯表達(dá),差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Heart:0.009%±0.007%vs0.023%±0.01%)(n=5,P㧐0.05);流式檢測NKp46-iCre;YFP(+/-)小鼠脾臟中NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的YFP陽性細(xì)胞的百分比為81.33%±1.43%、0.19%±0.08%、0.11%±0.009%,NK細(xì)胞中YFP陽性細(xì)胞的百分比明顯高于T細(xì)胞和B細(xì)胞。2.成功建立了在NK細(xì)胞內(nèi)Foxo1和PTEN雙基因同時缺失的小鼠模型,連續(xù)觀察小鼠46周,與對照組小鼠(Foxo1~(fl/fl)PTEN~(fl/fl))相比,Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠生長發(fā)育未見明顯異常,未形成自發(fā)性腫瘤;Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠的外周血、淋巴結(jié)、骨髓、脾臟中NK細(xì)胞的比例無明顯變化(BL:4.76%±0.46%vs4.17%±0.64%)(P㧐0.05,n=8);(LN:0.50%±0.10%vs 0.85%±0.20%)(P㧐0.05,n=8);(BM:1.13%±0.23%vs 1.31%±0.10%)(P㧐0.05,n=8);(SP:4.41%±0.65%vs 3.5%±0.24%)(P㧐0.05,n=8)。3.B16F10惡性黑色素瘤移植瘤小鼠模型建立后,與對照組(Foxo1~(fl/fl)PTEN~(fl/fl))相比,Foxo1~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠的生存時間無統(tǒng)計學(xué)差異(P㧐0.05,n=13)。［小結(jié)］NKp46-iCre介導(dǎo)的YFP報告基因標(biāo)記小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞具有特異性,抑癌基因Foxo1、PTEN在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生過程中可能不具備關(guān)鍵作用,同時缺失后對體內(nèi)NK細(xì)胞的腫瘤免疫監(jiān)視功能影響不大。第二部分:抑癌基因Foxo1和SHP-1在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生中的作用探索［方法］1.利用NKp46-iCre小鼠分別與Foxo1~(fl/fl)、SHP-1~(fl/fl)小鼠交配,得到NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)SHP-1~(fl/fl)(Foxo1~(△NK)SHP-1~(△NK))小鼠,即在NK細(xì)胞內(nèi)同時敲除Foxo1和SHP-1的小鼠,觀察小鼠的生長發(fā)育和成瘤情況。2.利用流式細(xì)胞術(shù),檢測NK細(xì)胞內(nèi)Foxo1和SHP-1雙基因缺失后小鼠主要淋巴器官中NK細(xì)胞的比例變化。［結(jié)果］1.成功建立了NK細(xì)胞內(nèi)特異性Foxo1和SHP-1雙基因缺失小鼠模型,連續(xù)觀察小鼠42周,與對照組小鼠(Foxo1~(fl/fl)SHP-1~(fl/fl))相比,小鼠生長發(fā)育未見明顯異常,未形成自發(fā)性腫瘤。2.與對照組相比,Foxo1~(ΔNK)SHP-1~(ΔNK)小鼠外周血和淋巴結(jié)中NK細(xì)胞比例明顯降低(BL:6.26%±0.478%vs 4.39%±0.23%)(P㩳0.01,n=3);(LN:0.431%±0.08%vs 0.17%±0.04%)(P㩳0.05,n=3);骨髓中NK細(xì)胞比例升高(BM:1%±0.09%vs 2.81%±0.76%)(P㩳0.05,n=3);脾臟和肝臟中淋巴細(xì)胞所占比例無統(tǒng)計學(xué)差異(SP:1.59%±0.07%vs 2.27%±0.76%)(P㧐0.05,n=3);(8.11%±2.99%vs 8.17%±0.73%)(P㧐0.05,n=3)。［小結(jié)］抑癌基因Foxo1和SHP-1在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生過程中可能不具備關(guān)鍵作用,同時缺失后影響小鼠體內(nèi)主要器官NK細(xì)胞的分布。第三部分:抑癌基因Foxo1和PTEN、染色體13q14在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生中的作用探索［方法］1.利用NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)13q14~(fl/fl)小鼠與PTEN小鼠交配,最終得到NKp46-iCre;Foxo1~(fl/fl)13q14~(fl/fl)PTEN~(fl/fl)(Foxo1~(△NK)13q14~(△NK)PTEN~(△NK))小鼠,即NK細(xì)胞內(nèi)特異性敲除Foxo1、13q14和PTEN小鼠,觀察小鼠的生長發(fā)育和成瘤情況。2.利用流式細(xì)胞術(shù),檢測NK細(xì)胞內(nèi)Foxo1、13q14和PTEN同時缺失后,小鼠主要淋巴器官內(nèi)的NK細(xì)胞的比例變化。［結(jié)果］1.成功建立了在NK細(xì)胞內(nèi)Foxo1、13q14、PTEN缺失小鼠模型,連續(xù)觀察小鼠42周,與對照組(Foxo1~(fl/fl)13q14~(fl/fl)PTEN~(fl/fl))相比,Foxo1~(△NK)13q14~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠生長發(fā)育未見明顯異常,未形成自發(fā)性腫瘤。2.與對照組相比,Foxo1~(△NK)13q14~(△NK)PTEN~(△NK)小鼠的外周血、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟中NK細(xì)胞所占比例無明顯變化。(BL:5.23%±0.87%vs 6.98%±2.04%)(P㧐0.05,n=5);(BM:1.21%±0.24%vs 1.49%±0.19%)(P㧐0.05,n=5);(LN:0.51%±0.11%vs 0.66%±0.04%)(P㧐0.05,n=5);(SP:2.51%±0.61%vs 2.76%±0.48%)(P㧐0.05,n=5)［小結(jié)］抑癌基因Foxo1、PTEN和染色體13q14在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生過程中可能不具備關(guān)鍵作用。［結(jié)論］Foxo1、PTEN同時缺失后對小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視功能影響不大。抑癌基因Foxo1、PTEN、SHP-1和染色體13q14在小鼠NK細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生過程中可能不具備關(guān)鍵作用。
【圖文】：

鼠交配策略和 PCR 鑒定結(jié)果（A-C: 繁殖產(chǎn)生 Foxo1△NK、P小鼠; D：NKp46、Foxo1 和 PTEN 的 PCR 結(jié)果）eneration and PCR results of NKp46-iCre mice (A-C: Strategy oand Foxo1△NKPTEN△NKmice; D: PCR results for NKp46-iCre td floxed PTEN alleles.)組織細(xì)胞中 YFP 表達(dá)情況細(xì)胞 術(shù)檢測 NKp46-iCre；ROSA26-YFP(+/-)和對6-YFP(-/-)小鼠的外周血、淋巴結(jié)、骨髓、脾臟、心臟百分比（圖 1-5）。與對照組相比，NKp46-iCre；RO淋巴結(jié)、骨髓、脾臟中細(xì)胞 YFP 表達(dá)的陽性細(xì)胞的

圖 1-2 各器官（外周血、淋巴結(jié)、骨髓、脾臟和心臟）的 YFP 的表達(dá)情況Fig. 1-2 The expression levels of YFP from various organs (blood, periphery lymph node, bonemarrow cell, spleen and heart)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.1

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本文編號：2690396