【摘要】：背景和目的:INK4基因位點(diǎn)的反義非編碼RNA(ANRIL)是一種長鏈非編碼RNA,最初是在患有家族性黑色素瘤的病人身上發(fā)現(xiàn)的。在那之后,越來越多的證據(jù)已經(jīng)確定了ANRIL對癌癥的發(fā)生和發(fā)展有影響。ANRIL編碼于染色體9p21區(qū)域,并已被證明可以調(diào)節(jié)其相鄰的、依賴于細(xì)胞的激酶抑制劑(CDKN)2a/2b,通過表觀遺傳機(jī)制來充當(dāng)腫瘤抑制因子。最近,一項(xiàng)研究表明,CDKN2B突變可能是家族性RCC的一個(gè)新原因。因此,我們假設(shè)ANRIL可能參與了RCC的發(fā)生發(fā)展�？紤]到目前學(xué)界對于ANRIL在RCC進(jìn)程中的作用知之甚少,因此揭示ANRIL在RCC中的調(diào)節(jié)作用是非常重要的。維甲酸和其他類維生素a(RAs)被大量用于皮膚病的預(yù)防和治療。在治療癌癥方面,維甲酸已經(jīng)被證明具有一定的功效。眾所周知,維甲酸會對幾種癌癥的正常細(xì)胞和異常細(xì)胞的體外增殖、分化和凋亡產(chǎn)生影響(結(jié)腸、前列腺、肺癌和白血病)。有報(bào)道稱,所有的反式維生素酸(ATRA)和9-cis RA都會影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的形態(tài)分化、增殖和基因表達(dá)。ATRA和13-cis RA業(yè)已被用于治療復(fù)發(fā)性惡性腦膠質(zhì)瘤。眾所周知,類維生素a具有抗人類惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和侵入性的活性,這表明類維生素a是一種合適的抗癌藥物,可以抑制腫瘤的發(fā)展。在最新的研究中,也揭示了維甲酸酰胺與其母體化合物在人類肝癌細(xì)胞凋亡中的作用。方法:1.在臨床腫瘤組織和4種RCC細(xì)胞株中,采用RT-PCR評價(jià)ANRIL的表達(dá)水平;2.轉(zhuǎn)染了ANRIL過表達(dá)載體后,對細(xì)胞存活、細(xì)胞集落數(shù)、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和腫瘤侵襲能力進(jìn)行評價(jià);3.對與細(xì)胞凋亡、上皮間質(zhì)過渡(EMT)和β-catenin信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行了評估,同時(shí)還評價(jià)了IWR-endo(β-catenin信號通路抑制劑)對細(xì)胞活力、轉(zhuǎn)移和入侵以及β-catenin信號通路蛋白表達(dá)的影響;4.為了研究維甲酸查爾酮(RAC)對細(xì)胞增殖和腎癌細(xì)胞凋亡的影響,利用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)來檢測癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡,并檢查細(xì)胞周期;5.利用westernblot和免疫組織化學(xué)方法,對腎細(xì)胞癌(RCC)和正常腎組織中的Notch1和Jagged1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果:1.ANRIL在RCC組織和RCC細(xì)胞系中得到了高度的表達(dá);2.ANRIL顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、入侵和EMT,但抑制細(xì)胞凋亡;3.β-catenin、Ki-67、糖原合成酶激酶3(gsk-3)、磷酸化gsk-3、T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子4(TCF-4)和白血病增強(qiáng)因子1(LEF-1)的表達(dá)水平都明顯受到了ANRIL的正調(diào)控;4.沉默ANRIL的生物功能與ANRIL過表達(dá)的生物功能相反。ARNIL對RCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和入侵的影響可以通過IWR-endo來逆轉(zhuǎn);5.在ACHN和769-p細(xì)胞中,用30μM RAC處理72 h后,處于G2/M期細(xì)胞的比例增加到45.27%和54.23%。同時(shí),處理后的769-p和ACHN腎細(xì)胞癌凋亡的比例約為59.27%和69.71%。高于對照組的5.23%和4.93%;6.與正常的腎組織相比,在腎癌組織中,Notch1和Jagged1陽性染色率分別為95.3%和93.0%。正常腎組織則分別為36.4%和42.4%。腎癌組織的治療在96小時(shí)后顯著降低了Notch1和Jagged1的染色率。結(jié)論:1.在RCC中高度表達(dá)的ANRIL,通過激活鏈狀途徑,在RCC細(xì)胞中充當(dāng)致癌物質(zhì);2.RAC可以誘導(dǎo)RCC在G2/M期停留,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使其成為治療腎細(xì)胞癌的有效藥物。
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文32（P<0.05 或 P<0.01）。在圖2B 中，相比于對照組，ANRIL 過表達(dá)的 786-O 和 A498細(xì)胞的相對細(xì)胞集落數(shù)都顯著地增強(qiáng)了（P<0.05 或 P<0.01）。而 ANRIL 沉默這兩種細(xì)胞的相對細(xì)胞集落數(shù)相比于對照組都顯著地減少了（P<0.05 或P<0.01）。ANRIL對細(xì)胞凋亡的影響與對細(xì)胞的生存能力影響完全相反。如圖2C所示，與對照組相比，ANRIL 過表達(dá)顯著地降低了（P<0.05）786-O 的凋亡率，，而 ANRIL的沉默對 786-O 細(xì)胞凋亡率有顯著的增加（P<0.05）。在圖 2D 中顯示了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。ANRIL 的過度表達(dá)顯著的下調(diào)了凋亡前體 Bax 的表達(dá)量，而 ANRIL 的沉默則顯著的上調(diào)了 Bax 的表達(dá)量�？沟蛲龅鞍� Bcl-2 的結(jié)果與 Bax剛好相反。ANRIL 的過度表達(dá)顯著的上調(diào)了 Bcl-2 的表達(dá)量，而 ANRIL 的沉默則顯著的下調(diào)了 Bcl-2 的表達(dá)量。從以上結(jié)果我們不難看出，ANRIL 可以有效的促進(jìn) RCC 細(xì)胞的增殖

第 4 章 ANRIL 影響腎癌細(xì)胞的作用機(jī)制路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)。在圖 4 C 和圖 4D 比值中，T 細(xì)胞因子-4（TCF-4）和淋巴增強(qiáng)因子-1（LEF-1）的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平都明顯受到了 ANRIL 過表達(dá)的明顯正調(diào)節(jié)（P<0.001）。而與 si-NC 組相比，ANRIL 沉默組這兩種蛋白的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.11

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