【摘要】：目的:參桃軟肝方是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,是國醫(yī)大師周岱翰教授多年來的臨床經(jīng)驗(yàn)方,有健脾養(yǎng)肝、軟堅(jiān)消ve之效,大量前期研究證明,參桃軟肝方治療乙肝病毒相關(guān)性肝癌患者臨床療效明確。HBx是HBV基因組四個(gè)開放閱讀框中,與肝癌關(guān)系最密切的一個(gè)基因。HBx與肝癌的發(fā)生密切相關(guān),HBx可通過DNA甲基化途徑促進(jìn)肝癌的發(fā)生。本課題觀察參桃軟肝方治療乙肝病毒相關(guān)性肝癌患者的作用機(jī)制,細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察參桃軟肝方的抑瘤功效,探討參桃軟肝方對(duì)乙肝病毒相關(guān)性肝癌Hbx表達(dá)的影響,揭示參桃軟肝方治療肝癌的分子機(jī)制,為參桃軟肝方臨床推廣應(yīng)用提供科學(xué)的理論支持。方法:1.臨床上,選取病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的確診為原發(fā)性肝癌;HBsAg陽性6個(gè)月以上,HBV-DNA載量5.0×102IU/mL的患者入組,給予參桃軟肝片口服,一次6片,一日3次。分別于服藥前及服藥后抽血檢測HBx啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平。2.按標(biāo)準(zhǔn)方法制備參桃軟肝方(STR)凍干粉,并將其作用于人肝癌HepG2.2.15細(xì)胞模型,CCK8檢測細(xì)胞生長抑制率,計(jì)算STR的IC50。取對(duì)數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞分別標(biāo)記為溶劑對(duì)照組、中藥加5-Aza-CdR組、5-Aza-CdR組、中藥組。通過Western blot檢測STR對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞株中HBx、DNMT1蛋白表達(dá)量的影響。熒光定量 PCR 檢測 HBx mRNA、DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA。將對(duì)數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1mg/mL的STR藥液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)后。利用BSP檢測HBx啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化水平。3.腋窩皮下注射HepG2人肝癌細(xì)胞懸液以建立BALB/c-nu小鼠肝癌移植瘤模型。按照小鼠體重、性別隨機(jī)分為模型組、STRGP低劑量組、STRGP中劑量組、STRGP高劑量組,每組8只。灌胃體積按小鼠體質(zhì)計(jì)算,均為0.1ml/10g,給藥頻次與給藥時(shí)程:每天1次,連續(xù)給藥4周。分別于給藥前、給藥第5天、第10天、第15.天、第20天、第30天測量瘤體大小,計(jì)算各組小鼠腫瘤體積。小鼠給藥30天處死后,剝離瘤體,稱重并測量瘤體。此外,取16只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠按雌雄、體重分層,隨機(jī)分組為對(duì)照組、中藥組每組8只。對(duì)照組每3日以生理鹽水灌胃。灌胃體積按小鼠體重計(jì)算,均為0.1ml/10g,中藥組參桃軟肝片采用臨床成人用藥劑量的等效劑量的4倍(劑量根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)設(shè)定),配置適量生理鹽水,37度加熱成混懸液,0.1ml/10g灌胃。給藥頻次與給藥時(shí)程:每天1次,連續(xù)給藥4周。其后采用摘眼球取血法收集小鼠血液,采用全自動(dòng)臨床生化分析儀及生化試劑檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)的含量;采用PCR檢測HBV-DNA載量。結(jié)果:1.臨床研究表明,STRGP可促進(jìn)乙肝病毒相關(guān)性肝癌患者HBx DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化。患者分別于服藥前后抽血檢測,由圖可見服用STRGP30天后,HBxDNA啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平由0.7%增加至48.5%,STRGP促進(jìn)了乙肝病毒相關(guān)性肝癌患者HBx DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,參桃軟肝方抑制HepG2.2.15細(xì)胞的生長呈時(shí)間和劑量依賴性。HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)過不同劑量(0.5mg/ml-2.5mg/ml)濃度梯度的STR處理24h、48h及72h后,與對(duì)照組比較,隨著STR濃度的升高細(xì)胞存活力較對(duì)照組降低。且在1.Omg/ml、1.5mg/ml、2.Omg/ml、2.5mg/ml 處,隨著 STR 處理時(shí)間的延長,HepG2.2.15細(xì)胞存活力呈降低的趨勢。STR抑制肝癌HepG2.2.15細(xì)胞生長,且該抑制呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性,同一時(shí)間點(diǎn)各濃度STR之間有顯著性差異(P0.001),同一濃度STR在各時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P0.001)。HepG2.2.15細(xì)胞72h半數(shù)抑制率IC50(Half Maximal Inhibition Concentration)數(shù)值為:0.6389 mg/ml。結(jié)果表明,STR 可抑制HepG2.2.15細(xì)胞的增殖,呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。Western blot檢測表明HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)過STR處理72h后,HBx蛋白表達(dá)量降低,STR組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),STR組與STR+5-Aza-C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),STR組與5-Aza-C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),即當(dāng)抑制DNMT1的表達(dá)時(shí),STR無法使HBx蛋白表達(dá)量降低。說明了 STR通過DNA甲基化抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步用熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平檢測STR對(duì)HBx、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)過STR處理72h后,HBx mRNA表達(dá)量降低,STR組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),STR組與STR+5-Aza-C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),即當(dāng)抑制DNMT1的表達(dá)時(shí),STR無法降低HBx mRNA表達(dá)量。這進(jìn)步一說明可STR通過DNA甲基化抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBx mRNA的水平。HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)過STR處理72h后與對(duì)照組比較,DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA的表達(dá)量均有升高,但STR組與Con組DNMT1 mRNA相比較無顯著性差異P=0.1244(P0.05);STR 組與 Con 組 DNMT3A mRNA 相比較無顯著性差異 P=0.264(P0.05;STR組與Con組DNMT3BmRNA相比較無顯著性差異P=0.3449(P0.05)。本研究通過觀察STR作用HepG2.2.15后HBx表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)STR可以在蛋白質(zhì)及RNA水平抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBx的表達(dá)。進(jìn)一步加入5-Aza-C后,發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)及RNA水平,STR均無法抑制HBx的表達(dá),說明在HepG2.2.15細(xì)胞中,STR通過DNA甲基化來抑制HBx的表達(dá)。BSP實(shí)驗(yàn)表明參桃軟肝方可促進(jìn)HepG2.2.15細(xì)胞HBx的甲基化,可以看到STR 1mg/mL作用72小時(shí)后HBx啟動(dòng)子區(qū)由原來的非甲基化變?yōu)榈图谆?HBx DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平由0%增加至68.1%。3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn),STRGP作用于BALB/c-nu小鼠肝癌移植瘤模型后,接種HepG2細(xì)胞一周后,裸鼠腋下皮膚肉眼可見移植瘤體,分組給藥前保持瘤體在同一基線水平,然后分組給藥統(tǒng)計(jì)分析得出,在給藥前各組瘤體大小無差別,給藥后第10天,與模型組相比較,STRGP高劑量組移植瘤體積偏小,兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P0.05)。給藥后第15天、第20天、第30天,與模型組相比較,STRGP高劑量組移植瘤體積顯著偏小,兩組比較有顯著性差異(P0.001)。該統(tǒng)計(jì)結(jié)果說明STRGP高劑量可抑制裸鼠HepG2移植瘤體積的增長并且該抑制作用會(huì)伴隨給藥時(shí)間的增加而增強(qiáng)。給藥后第15天、第20天、第30天,與STRGP低劑量組相比較,STRGP高劑量組移植瘤體積顯著偏小,兩組比較有顯著性差異(P0.001)。給藥后第15天,與STRGP中劑量組相比較,STRGP高劑量組移植瘤體積顯著偏小,兩組比較有顯著性差異(P0.01)。給藥后第20天、第30天,與STRGP中劑量組相比較,STRGP高劑量組移植瘤體積顯著偏小,兩組比較有顯著性差異(P0.001)。STRGP低劑量和高劑量組與模型組比較,瘤體重量都有下降。STRGP有抑制腫瘤重量的作用,F=19.56,P=0.0126(P0.05),兩兩比較中,STRGP高劑量與模型組比較,瘤體重量有顯著性差異(P0.01);STRGP高劑量與STRGP低劑量組比較,瘤體重量有顯著性差異(P0.01);STRGP高劑量與STRGP中劑量組比較,瘤體重量有顯著性差異(P0.01)。STRGP高劑量組可以抑制移植瘤體積以及瘤體重量的增長。STRGP作用于HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,給藥前取血清檢測16只轉(zhuǎn)基因小鼠HBV-DNA載量,兩組小鼠實(shí)驗(yàn)前HBV-DNA載量在同一基線水平,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P=0.4805(P0.05)。比較給藥后STRGP組與對(duì)照組HBV-DNA載量,發(fā)現(xiàn)STRGF組HBV-DNA定量均數(shù)較對(duì)照組低,但二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P=0.6453(P0.05)。STRGF對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝功能的影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果:STRGF較對(duì)照組比較,可降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠AST數(shù)值,兩組比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P=0.001。STRGF較對(duì)照組比較,可降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠ALT數(shù)值,兩組比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P=0.0087,(P0.001)。STRGF組與對(duì)照組轉(zhuǎn)基因小鼠相比,STRGF組ALP數(shù)值無顯著差異,P=0.5347(P0.05)。STRGF組與對(duì)照組轉(zhuǎn)基因小鼠相比,STRGF組ALB數(shù)值無顯著差異,P= 0.3777(P0.05)。STRGF組與對(duì)照組轉(zhuǎn)基因小鼠相比,STRGF組PA數(shù)值無顯著差異,P=0.1558(P0.05)。STRGF組與對(duì)照組轉(zhuǎn)基因小鼠相比,STRGF組D-BIL數(shù)值無顯著差異,P=0.2634(P0.05)。STRGF組與對(duì)照組轉(zhuǎn)基因小鼠相比,STRGF組T-BIL數(shù)值無顯著差異,P=0.6403(P0.05)。結(jié)論:1.STR治療肝癌療效明確,本實(shí)驗(yàn)臨床研究表明STR可以促進(jìn)HBV相關(guān)性肝癌患者HBx DNA啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化,而HBx被認(rèn)為是HBV基因組編碼的蛋白中與肝癌關(guān)系最密切的蛋白之一,HBx可以通過各種途徑導(dǎo)致肝癌的發(fā)生發(fā)展,啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可抑制HBx蛋白的表達(dá),從而達(dá)到抑制肝癌生長的目的。本研究清晰揭示了臨床中STR治療肝癌的分子機(jī)制,促進(jìn)了 STR的臨床推廣應(yīng)用。2.STR能抑制穩(wěn)轉(zhuǎn)HBV基因組的人肝癌細(xì)胞株的生長,且抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。3.STR通過DNA甲基化抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)。4.STR通過DNA甲基化抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBx mRNA的表達(dá)。5.STR能抑制裸鼠HepG2肝癌移植瘤的體積及重量的增長,且抑制作用隨著給藥時(shí)間的延長而增加。6.STR能改善HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝功能的損傷,降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的AST、ALT指標(biāo)。
【圖文】：

[105]。隨著對(duì)肝癌的深入了解，大量研究證實(shí)了表觀遺傳學(xué)在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。表觀遺傳學(xué)包括了 DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重組、核小體的重塑等，其中在肝癌中，DNA 甲基化研究最為廣泛[106-108]。正常組織中表觀遺傳學(xué)的改變可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。例如，肝硬化多為肝癌的前導(dǎo)疾病，這可能與引起肝硬變的慢性肝細(xì)胞損傷以及炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的全基因組 DNA甲基化改變有關(guān)。但支持這一理論的研究尚存在爭議。Kondo[109]等人研究發(fā)現(xiàn)正常肝組織與肝硬變組織二者的 DNA 甲基化水平無差異。然而，有研究者證實(shí)了在肝硬化患者以及肝炎患者中，存在甲基化水平增高以及腫瘤抑癌基因功能喪失[110]。p16 的超甲基化會(huì)導(dǎo)致了 p16 基因的失活，而 p16 啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平增高與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)[111]。研究者還檢測了被增生性結(jié)節(jié)以及肝硬變結(jié)節(jié)包裹的肝細(xì)胞癌中 p16 甲基化水平，證實(shí)了在肝癌早期 p16 超甲基化的現(xiàn)象，清楚的揭示了從肝硬化結(jié)節(jié)發(fā)展到增生性結(jié)節(jié)的肝癌發(fā)生過程。此外，研究者通過對(duì)肝癌組織以及正常組織的對(duì)比發(fā)現(xiàn) APC,GSTP1, RASSF1A, p16, COX-2 以及 E-cadherin 甲基化水平有變化[112-114]。因此我們可以推測肝硬變導(dǎo)致 DNA 甲基化以及表觀遺傳學(xué)的改變從而引起早期肝癌的發(fā)生（如圖 1 所示）。

圖 2. HBV 基因組圖譜[125]Figure 2. Hepatitis B virus (HBV) genome map.V 的基因組是雙鏈 DNA (3.2 kb)，，其中包含四個(gè)重疊的開放閱讀框架(ORFs)分別pre-S1/pre-S2/S)(藍(lán)色箭頭)，核心蛋白(pre-C/C)(黃色箭頭)，病毒聚合酶(綠箭色箭頭)。基因組包含四個(gè)啟動(dòng)子，兩個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域(Enh1, Enh2)和兩個(gè)直接重patitis B virus x (HBx)是一種高度保守的含有 154 氨基酸蛋白質(zhì)，分7 kDa。因?yàn)榘被嵝蛄信c任何已知的蛋白質(zhì)都不同源，故 HBx 即為蛋白[122]。它主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，在肝細(xì)胞的細(xì)胞核中較少[123]。由于 HBV到宿主基因組中，即使在沒有完整的 HBV 病毒復(fù)制的情況下 HBx 基因也胞中維持存在和轉(zhuǎn)錄[124,125]。HBx 蛋白并不直接與 DNA 結(jié)合，而是激活各啟動(dòng)子和增強(qiáng)子[123]。HBx 可以調(diào)節(jié)和激活各種基因的表達(dá)，有表觀調(diào)節(jié)乙�；iRNAs 和 lncRNAs)，且可導(dǎo)致各種通路及功能的異常(詳見
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

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