【摘要】：目的:構(gòu)建基于微流控芯片的肝腎組織培養(yǎng)技術(shù)平臺,進(jìn)而在該平臺上研究腫瘤細(xì)胞外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。材料和方法:本實驗采用常規(guī)紫外光刻膠技術(shù)制備SU-8模板,灌注聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),獲得微流控芯片的膜片,打孔后使用預(yù)聚物熱固化的方法完成膜片與多孔膜的封接,夾具夾緊備用。本實驗所用細(xì)胞包括人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)、乳腺癌(Breast cancer,BC)細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF7,分別使用ECM、L-15、DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。微流控芯片組織培養(yǎng)池底部用1:8的Matrigel(BD公司)包被后接種HUVEC,待細(xì)胞生長達(dá)到緊密連接,使用分子量為10 k Da的FITC-Dextran評價其滲透性。實驗動物選取1~2周齡SD大鼠,麻醉后取大鼠的肝和腎組織,使用徠卡活組織振動切片機(jī)VT1200S制備直徑5 mm厚度250μm的精密組織切片(Precision-cut Tissue Slices,PTS)本文中包括精密肝切片(Precision-cut Liver Slices,PLS)、精密腎切片(Precision-cut Kidney Slices,PKS),置于微流控芯片組織培養(yǎng)池內(nèi)培養(yǎng)。采用注射泵驅(qū)動微通道內(nèi)的培養(yǎng)液以0.75μL/min恒定流速對PTS進(jìn)行灌流培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)的PLS、PKS各分為兩組,一組用Hoechst33342、Rh-123和PI聯(lián)合染色,直接鑒定PTS內(nèi)的細(xì)胞活性;另外一組多聚甲醛固定,OCT包埋,蘇木精和伊紅染色檢查組織結(jié)構(gòu)的完整性,使用Ki67抗體進(jìn)行免疫熒光染色考察細(xì)胞的增殖能力,CXCL12抗體進(jìn)行免疫熒光染色檢測PTS趨化因子分泌功能。采用培養(yǎng)0 h的PTS作為對照組。收集MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)基,采用商品化外泌體提取試劑盒Total Exosome Isolation分別提取兩種細(xì)胞分泌的外泌體。透射電鏡成像觀察外泌體形態(tài)。蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB)鑒定外泌體蛋白表達(dá),具體檢測指標(biāo)包括CD63、CD81、Hsp70、CXCR4、GAPDH。將PKH67標(biāo)記的MDA-MB-231外泌體加入PTS培養(yǎng)微流控芯片內(nèi),與PTS共孵育30 min、60 min,之后考察外泌體的組織趨向性。動物實驗選取2周齡的SD大鼠,鼠尾靜脈注射PKH67標(biāo)記的MDA-MB-231外泌體(10μg),24 h后麻醉大鼠,取肝、腎組織,多聚甲醛固定,OCT包埋,制備冰凍切片,DAPI染色,檢查外泌體的組織趨向性。利用ELISA試劑盒分別檢測PLS、PKS的CXCL12分泌量。外泌體組織趨向抑制實驗選取CXCR4受體拮抗劑AMD3100,使用梯度濃度的AMD3100與MDA-MB-231外泌體孵育過夜,然后將外泌體加入PTS培養(yǎng)微流控芯片通道內(nèi)與組織培養(yǎng)池內(nèi)的PTS共孵育,考察外泌體的肝趨向性抑制情況。動物實驗選取2周齡SD大鼠,在10μg/100μL熒光標(biāo)記MDA-MB-231外泌體稀釋液體系中,加入AMD3100使其終濃度達(dá)2μg/m L后共孵育過夜,鼠尾靜脈注射,24 h后麻醉大鼠,取肝和腎組織檢查外泌體的組織趨向性。結(jié)果:本研究構(gòu)建的PTS培養(yǎng)微流控芯片從下向上依次為:下層PDMS膜片,蝕刻有微通道;聚碳酸酯膜,布滿8μm孔徑的微孔;中間層PDMS膜片,有2個組織培養(yǎng)池;頂層PDMS膜片,用于封閉組織培養(yǎng)池;整體使用夾具夾緊備用。將大鼠的肝和腎組織制成直徑5 mm、厚度250μm的PTS,在PTS培養(yǎng)微流控芯片的培養(yǎng)池內(nèi)灌流培養(yǎng)24 h。與體外培養(yǎng)0 h的對照組PTS相比較,Hoechst33342、Rh-123和PI聯(lián)合染色顯示兩種PTS內(nèi)的細(xì)胞均保持良好的活性,活性率達(dá)90%以上;HE切片顯示兩種PTS均保持完整的組織結(jié)構(gòu);Ki67染色結(jié)果顯示PTS內(nèi)的細(xì)胞保持良好的增殖能力;CXCL12染色結(jié)果顯示PTS保有趨化因子分泌功能。這部分結(jié)果提示基于微流控芯片的PTS培養(yǎng),至少在24 h內(nèi)可以維持PTS的細(xì)胞活性、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增殖能力和趨化因子分泌功能。進(jìn)而,我們基于該微流控芯片考察了腫瘤細(xì)胞外泌體的組織趨向性。從MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞培養(yǎng)液中分離獲得外泌體,電鏡檢查結(jié)果顯示外泌體為標(biāo)準(zhǔn)茶托狀雙層膜結(jié)構(gòu),WB結(jié)果顯示外泌體表達(dá)典型的標(biāo)志物,如CD63、CD81、Hsp70蛋白等。基于微流控芯片的外泌體組織趨向性實驗結(jié)果顯示,與腎組織比較,MDA-MB-231外泌體(p0.001)和MCF7外泌體(p0.01)具有明顯的肝趨向性,且高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA-MB-231比低轉(zhuǎn)移細(xì)胞MCF7的肝趨向性更強(qiáng)(p0.001)。大鼠體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,MDA-MB-231(p0.0001)和MCF7(p0.0001)外泌體具有明顯的肝趨向性,在腎組織幾乎找不到這兩種細(xì)胞的外泌體,而且在肝組織MDA-MB-231外泌體顯著多于MCF7外泌體(p0.0001)。CXCR4免疫熒光染色和WB結(jié)果均顯示兩種BC細(xì)胞均高表達(dá)CXCR4,而且WB結(jié)果顯示BC細(xì)胞外泌體表達(dá)CXCR4。此前,我們已經(jīng)分別利用免疫熒光染色法和ELISA試劑盒法證實了PLS中及其分泌的CXCL12量顯著高于PKS。這一結(jié)果提示CXCL12/CXCR4生物軸可能在BC細(xì)胞外泌體的肝趨向性中發(fā)揮一定作用。因此,我們使用梯度濃度的CXCR4受體拮抗劑AMD3100處理MDA-MB-231外泌體后,在微流控芯片上考察了AMD3100對MDA-MB-231外泌體肝趨向的拮抗作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨AMD3100濃度升高M(jìn)DA-MB-231外泌體的肝趨向性顯著降低,呈明顯劑量依賴(0.5μg/m L,p0.05;1μg/m L,p0.01;2μg/m L,p0.001)。大鼠實驗同樣證實AMD3100可有效抑制MDA-MB-231外泌體在肝組織的定植灶數(shù)量(p0.05)。結(jié)論:(1)本研究構(gòu)建了PTS培養(yǎng)的微流控芯片及其操作方法,基于該芯片的PTS培養(yǎng)24 h內(nèi)可良好地保持細(xì)胞活性、組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞增殖能力和趨化因子分泌功能。(2)微流控芯片PTS培養(yǎng)和動物實驗結(jié)果均證實BC細(xì)胞外泌體具有明顯的肝趨向性。(3)CXCL12/CXCR4生物軸在BC細(xì)胞外泌體的肝趨向性中發(fā)揮一定的作用。
【圖文】：

圖 1 PTS 培養(yǎng)微流控芯片的構(gòu)建（A）基于微流控芯片的 PTS 培養(yǎng)模式圖；（B）基于微流控芯片的 PLS 培養(yǎng)示意圖；（C）P制備過程及微流控芯片實物圖。基于微流控芯片的 PTS 培養(yǎng)模式圖如圖 1A 所示，芯片主體部分為四層，下至上分別為：（1）第一層 PDMS 膜片，該層刻蝕有兩條微通道，，每個微通道

在下層微通道內(nèi)灌注培養(yǎng)液，流速為 0.75 μL/min。PLS 完好地保存了肝細(xì)胞、管細(xì)胞、枯否細(xì)胞、星形細(xì)胞，以及 ECM。PTS 制備過程及微流控芯片實物圖圖 1C。2. 微流控芯片培養(yǎng) PTS 的活性、組織結(jié)構(gòu)、增殖能力、趨化因子分泌功能的檢
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730

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本文編號：2685273